生物信息学分析髓系细胞触发受体-2对低级别胶质瘤的影响

杨绪东，陶瑞明

［ 沧州市第四医院（南皮县人民医院）神经内科，河北 沧州 061500 ］

胶质瘤（glioma）是最常见的颅内恶性肿瘤，根据2007 年世界卫生组织制定的分类标准，胶质瘤分为四级：Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤被称为低级别胶质瘤（low-grade glioma,LGG），Ⅲ级和Ⅳ级被称为高级别胶质瘤（high-grade glioma,HGG）［1-2］。其中LGG 占胶质瘤总发病率的15%～25%，主要包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突胶质星形细胞瘤［3］。LGG 的临床表现不明显，54%的患者出现头痛，26%的患者出现癫痫发作，还有很多患者没有临床表现，所以LGG 的早期发现及诊断仍没有较好的方法。此外，与HGG 相比，LGG 生长缓慢，生存期较长，但是如果不及时诊断及治疗，所有LGG 最终都会进展为HGG，导致患者生存率降低甚至死亡［4］。因此，寻找LGG 发生发展的相关标志物，对于LGG 的早期发现，早期诊断及治疗具有重要意义。髓系细胞触发受体-2（triggering receptor expresses on myeloid cells-2,TREM-2）属于免疫球蛋白（Ig）跨膜受体超家族成员，是树突状细胞和巨噬细胞等髓样细胞的膜表面受体，主要通过与接头蛋白DAP-12 结合来向细胞内传递信号［5］。TREM-2 与炎症反应密切相关。TREM-2 能抑制巨噬细胞活化，抑制白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等促炎因子的释放，从而发挥抑制炎症的作用［6］。活化的巨噬细胞分为M1型和M2 型，前者发挥促炎作用，后者具有抑制炎症作用，TREM-2 在M2 型巨噬细胞膜上的表达增强，也提示其能下调巨噬细胞等抗原提呈细胞的功能及炎症因子的释放［7］。近年来，TREM-2 的免疫识别功能在肿瘤中的作用引起越来越多的关注。TREM-2 在肺癌［8］、肝癌［9-10］、结直肠癌［11］及黑色素瘤［12］的发生发展中发挥重要调控作用，但是TREM-2 在LGG 发生发展过程中的作用研究较少。为进一步明确TREM-2 在LGG 肿瘤组织中的表达情况及对恶性表型形成的机制，本研究以TCGA数据库为基础，分析TREM-2 在LGG 中的表达情况及对患者总体生存率的影响，以期为LGG 的早期发现、早期诊断及治疗提供潜在的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 TREM-2 基因在人LGG 肿瘤组织和正常组织中的表达差异

运用在线分析软件GRPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）对TCGA 数据库中提供的LGG 患者临床数据进行分析，分析TREM-2 在LGG 肿瘤组织和正常组织中的表达差异。具体操作步骤为：在 GRPIA2 在线网站中选择“Expression Analysis”模块下的“Expression DIY”进行分析。顶部选择箱式图“Box Plot”后，输入“TREM2”基因，肿瘤类型选择“LGG”，差异阈值等其他参数默认，点击“Plot”得到TREM-2 在LGG 肿瘤组织和正常组织表达差异的柱状图。

1.2 TREM-2 表达与LGG 患者临床病理特征的关系

在 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）网站首页顶部点击“TCGA”分析模块，然后选择“TCGA Gene analysis”，输入基因名称“TREM2”，在TCGA dataset 处选择肿瘤类型“Brain lower grade glioma”，点击“Explore”进行分析，然后在 links for analysis 分析下点击“Expression”，得到TREM2 的表达与LGG 患者年龄、性别、种族、肿瘤分级、组织学分型等临床病理特征之间的关系。

1.3 TREM-2 表达对LGG 患者总体生存的影响

采用UALCAN 和GEPIA2 两个在线网站分析TREM-2 的表达异常对LGG 患者总体生存率及无病生存率的影响。具体分析步骤如下：同样在UALCAN 网站“TCGA Gene analysis”模块下输入基因名称和肿瘤类型，点击“Explore”进行分析，然后在links for analysis 分析下点击“Survival”得到生存曲线图；在GRPIA2 在线网站中选择“Expression Analysis”模块下的“Survival Analysis”进行分析，输入基因名称，添加癌症类型，选择OS（总体生存率）还是RFS（无病生存率），点击“Plot”得到最终的生存分析结果。

1.4 与TREM-2 基因相关的信号通路富集

在UALCAN 在线分析网站中检索出与TREM-2呈正相关和负相关的基因，其中正相关基因的相关系数（r）需在0.3～0.9 之间，负相关基因的相关系数（r）需在-0.6～-0.3 之间。然后分别将符合要求的正相关基因和负相关基因输入DAVID6.8 在线软件（https：//david.ncifcrf.gov/），对其进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集。

1.5 分析TREM-2 基因在LGG 中的免疫浸润水平

在 TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）在线数据库中检索TREM-2 的表达与LGG纯度和免疫浸润程度之间的关系。在TIMER 中，基因表达与肿瘤纯度之间的相关性使用Pearson 分析来计算，基因表达与6 种免疫细胞浸润程度之间的关系采用Spearman 分析，偏相分析方法可以排除肿瘤纯度对分析免疫细胞浸润的影响。

1.6 统计学方法

统计分析采用SPSS 17.0 软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和t检验（Student's test），P＜0.05 为差异有统计学意义；Kaplan-Meier 分析用于患者总体生存率分析；R4.0.5 版软件及ggplot2 包用于KEGG 通路富集绘图。

2 结果

2.1 TREM-2 基因在人LGG 肿瘤组织和正常组织中的表达差异

GEPIA2 在线网站纳入的LGG 肿瘤患者为518例，正常对照207 例；结果发现与正常对照组相比，TREM-2 在LGG 肿瘤组织中的表达高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 TREM-2 在LGG 肿瘤组织和正常组织中的表达差异

2.2 TREM-2 的表达与LGG 患者临床病理特征的关系

TREM-2 的表达水平与LGG 患者的年龄，性别及种族不相关（P＞0.05）。与患者肿瘤分级（Grade-2vs.Grade-3，P＜0.05），组织学分型（星形细胞瘤vs.少突胶质星形细胞瘤vs.少突胶质细胞瘤，P＜0.05）相关，见图2。

2.3 TREM-2 表达对LGG 患者总体生存率和无病生存率的影响

采用UALCAN 和GEPIA2 网站分别分析了TREM-2 低表达和高表达对LGG 患者总体生存率的影响。图3A 是UALCAN 网站分析结果，包括LGG 低表达患者382 例，高表达患者129 例，分析结果表明TREM-2 表达越高，LGG 患者的总体生存率越低（P=0.00025）。图3B 是GEPIA2 网站分析结果，纳入LGG 低表达和高表达患者分别为257 例，结果同样表明TREM-2 表达越高，LGG 患者的总体生存率越低（P=0.0029）。此外，TREM-2高表达会造成LGG 患者的无病生存期缩短（P=0.015）（图3C）。

图3 TREM-2 表达对LGG 患者总体生存率及无病生存率的影响

2.4 TREM-2 相关基因信号通路富集

采用UALCAN 在线网站检索与TREM-2 相关的基因。其中正相关基因1 585 个，相关系数（r）在0.87～0.3 之间，负相关基因1 554 个，相关系数（r）在-0.54～-0.3 之间。分别将正相关基因和负相关基因输入DAVID6.8 在线软件进行KEGG 通路富集。1 585 个正相关基因共富集在76 条通路中，其中参与基因数量≥15 个的信号通路有60条，主要涉及结核、癌症通路、吞噬体、HTLV-1感染、肌动蛋白细胞骨架的调节、破骨细胞分化、Epstein-Barr 病毒感染及单纯疱疹感染等通路（图4）。1 554 个负相关基因共富集在74 条通路中，其中参与基因数量≥15 个的信号通路有36 条，主要涉及MAPK 信号通路、神经活性配体-受体相互作用、谷氨酸能突触及多巴胺能突触等（图5）。

图4 与TREM-2 正相关基因的KEGG 通路富集气泡图

图5 与TREM-2 负相关基因的KEGG 通路富集气泡图

2.5 LGG 中TREM-2 基因的免疫细胞浸润

在TIMER 在线数据库中分析LGG 中TREM-2表达与肿瘤微环境中6 种免疫细胞浸润程度之间的相关性。结果表明，TREM-2 的表达与B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润呈正相关，见图6。

图6 TREM-2 表达与免疫细胞浸润的相关性分析

3 讨论

TREM-2 编码一种在髓系细胞表面表达的天然免疫受体，能调控巨噬细胞和树突状细胞，进而参与调控机体的免疫反应，在TLR 配体刺激下可以和接头蛋白DAP12 耦合，引起下游信号通路的级联反应，负性调控DC 和巨噬细胞，进而调节炎症反应［13-15］。由于炎症介质以及免疫炎症级联反应的激活能够诱导细胞DNA 损伤或者基因突变，导致细胞异常增殖，最终诱发癌变［16-17］。有研究表明［8］，在肺癌患者巨噬细胞中，TREM-2 的表达水平明显增加，并且与肺癌的恶性等级呈正相关，且体外实验进一步证明Leiws 肺癌细胞高转移株（3LL）诱导巨噬细胞高表达TREM-2，同时3LL诱导的荷瘤鼠体内IL-12 分泌减少，IL-10 分泌增加，T 细胞增殖抑制，提示其有促进肺部肿瘤生长的作用。此外，在结直肠癌中，TREM-2 会影响肠道菌群平衡［18］，有助于结直肠癌的产生。另一方面，敲除TREM-2 能降低IL-23，IL-6 等炎症因子的表达，进而影响结直肠癌的进展，表现为肿瘤病灶减小，肿瘤增殖速度减慢、肿瘤分级水平降低等［11］，提示TREM-2 可能对结直肠癌的发生发展有促进作用。然而，对于TREM-2 在LGG 中的表达情况及在LGG 发生发展中的作用研究较少。

本研究基于TCGA 数据库，采用生物信息学的方法，初步发现TREM-2 在LGG 肿瘤组织中的表达是高于正常组织；病例特征分析发现，LGG与患者肿瘤分级呈正相关，并且还和组织学分型有关，在星形胶质细胞瘤、少突胶质星形细胞瘤及少突胶质细胞瘤中的表达依次降低，差异有统计学意义，而与患者的年龄、性别及种族等不相关。对患者生存分析结果表明，TREM-2 表达越高，LGG 患者的总体生存率和无病生存率越低。TREM-2 的免疫-炎症调节作用可能是其影响LGG进展的重要机制之一，研究发现差异表达TREM-2与肿瘤微环境中的B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等6种免疫细胞的浸润程度呈正相关，表明TREM-2的表达对LGG 的免疫微环境具有影响，能够调控肿瘤的免疫微环境。TREM-2 对肿瘤免疫微环境的调节目前已经有相关文献报道。对肿瘤微环境的scRNA-seq 序列研究表明，TREM-2 在多个髓样细胞亚群中表达，尤其是巨噬细胞亚群，TREM-2 巨噬细胞的富集是肝细胞癌患者不良临床结局的独立指标［19］。MOLGORA 等［20］人发现TREM-2 敲除小鼠对MCA 诱导的肉瘤、结直肠癌和乳腺肿瘤更具抵抗力，并且证明PD-1 抗肿瘤免疫治疗对TREM-2 缺陷小鼠比WT 荷瘤小鼠更有效。单细胞RNA 测序分析髓系细胞表明，TREM-2 缺乏和抗TREM-2 单抗治疗均引发浸润肿瘤的巨噬细胞群显著改变，说明TREM-2 是人类肿瘤浸润巨噬细胞的标志物，是补充检查点免疫治疗的一个新途径，但是TREM-2 调控肿瘤免疫微环境的机制还需深入研究。

综上所述，TREM-2 在LGG 发生发展中可能是一个促癌基因，其对肿瘤的调节作用可能与肿瘤免疫-炎症微环境相关，这为进一步研究TREM-2在LGG 的免疫治疗提供了新的见解和思路，为LGG 早期诊断、早期治疗提供了潜在靶点。但是，本研究也存在一定局限性，没有在体外进一步研究TREM-2 对LGG 增殖、迁移、侵袭等恶性表型及其调控免疫微环境的具体机制，未在动物实验中进一步探究其作用来全面研究TREM-2 在调控LGG 中发挥的作用。