miR-186对HL-60细胞增殖、迁移的调控及机制研究

刘 洋,高长俊

1.河北省保定市第二中心医院检验科,河北保定 072650;2.河北省唐山市妇幼保健院小儿血液科,河北唐山063000

急性髓系白血病发病时原始髓样细胞出现异常增生,抑制了正常细胞的造血功能,其发病率呈逐年上升趋势[1]。临床上通常采用化疗的方法来治疗急性髓系白血病,但存在药物的不良反应及药物耐药等问题。因此,探索安全、有效的新方法对治疗急性髓系白血病的意义重大。

微小RNA(miRNA)是一种小分子RNA,有多项研究在宫颈癌、前列腺癌等多种癌细胞中均发现miRNA家族在细胞增殖和转移等生物学行为过程中发挥重要调控作用[2-6]。研究表明miRNA能够影响血液系统肿瘤的发生、发展,在调控人体造血过程中具有非常重要的作用[7-8]。现已证实miRNA在包括急性髓系白血病在内的血液肿瘤中具有原癌基因或抑癌基因的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通过磷酸化激活丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)进而对下游的多种靶分子的活性产生影响。PI3K/AKT通路参与多种肿瘤细胞的增殖和迁移等过程[9]。关于PI3K/AKT通路介导急性髓系白血病前人也有研究[10]。有文献报道,在肺腺癌中,miRNA-186(miR-186)参与肿瘤细胞的增殖和迁移是通过介导PI3K/AKT通路完成的[11-12]。但关于miR-186介导PI3K/AKT通路调控人原髓细胞白血病HL-60细胞增殖、迁移等过程的作用机制尚未明确。因此,本研究通过研究miR-186调控PI3K/AKT通路在HL-60细胞增殖、迁移及上皮间质转化(EMT)过程中的作用,为研究急性髓系白血病提供新的理论依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 HL-60细胞购自北纳生物;PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)、PI3K/AKT通路激活剂(SC79)购自上海源叶生物科技有限公司,纯度≥98%,货号为S43088、S80614;miR-186、阴性对照片段(mimic NC)由上海生工公司进行设计并合成;Lipofectamine 2000阳离子脂质体购自美国Invitrogen公司,货号为C0075S;5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天公司,货号为P0013B;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,货号为RR820A;鼠抗人磷酸化(p)-PI3K购自上海户实公司,货号为HK5745;鼠抗人PI3K货号为10017175,鼠抗人AKT货号为10022173,p-AKT货号为10022023,N-钙黏蛋白(N-cadherin)货号为10010628,E-钙黏蛋白(E-cadherin)货号为1004426,波形蛋白(Vimentin)货号为10017978,纤维粘连蛋白(FN)货号为10016772,肌动蛋白(β-actin)货号为10021787,辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)货号为20000425且均购自武汉三鹰生物技术有限公司。 HF151型CO2培养箱购自武汉益普生物科技有限公司;DMI1型光学显微镜系统购自德国Leica公司;Multiskan Ascent型酶标仪购自美国Thermo公司;ZF-288型凝胶成像系统购自上海金鹏分析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1HL-60细胞培养 HL-60细胞株大鼠心肌细胞(H9C2)接种于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中,并置于湿度为70%～80%,温度为37 ℃,含5% CO2的环境下进行培养,更换培养液间隔时间为2 d,选取对数期生长细胞用于实验。

1.2.2分组及细胞转染 选取对数期生长的HL-60细胞,按照不同干预内容分为5组(对照组,mimic NC组、miR-186组、miR-186+抑制剂组、miR-186+激活剂组)。对照组不做处理;mimic NC组采用脂质体转染法将mimic NC转染于HL-60细胞(转染后培养24 h);miR-186组将miR-186 转染于HL-60细胞(转染后培养24 h);miR-186+抑制剂组和miR-186+激活剂组细胞处理方法为转染miR-186于HL-60细胞(转染后培养24 h)后,分别加入LY294002和SC79,使其最终水平均达到10 μmol/L,干预24 h,每组设置3个复孔。

1.2.3检测miR-186及EMT相关因子相对表达水平 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测HL-60细胞中miR-186相对表达水平及EMT相关因子(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、FN)信使核糖核酸(mRNA)相对表达水平,参照试剂盒的说明书,提取总RNA,并进行反转录,随后进行RT-qPCR检测。测定miR-186相对表达水平时以U6作为管家基因,测定EMT相关因子mRNA相对表达水平时以GAPDH作为管家基因。采用2-ΔΔCt法对目的基因相对表达水平进行计算。引物序列见表1。

表1 miR-186及EMT相关因子的引物序列

1.2.4EdU法测定HL-60细胞的增殖率 将转染24 h后的HL-60细胞进行EdU孵育2 h,固定30 min,加入0.3% TritonX-100表面活性剂透化10 min;在每孔中加入100 μL Click反应液避光孵育30 min,再进行常规的Hoechst复染;装片后,观察并采集在荧光显微镜下的EdU红色荧光信号和Hoechst 33342蓝色荧光信号,采用ImageJ V1.8.0软件确定细胞数目。细胞增殖率为EdU阳性染色细胞(红色)占总细胞(蓝色)的百分比。

1.2.5Transwell小室法测定HL-60细胞的迁移能力 将转染后的HL-60细胞接种到24孔板Transwell小室中,加入无血清的细胞悬液,并在下室中加入含10% FBS的RPMI-l640培养基。培养24 h后,收集下室悬液,细胞浓缩计数,然后置于显微镜下随机选取3个视野,用细胞计数板计算细胞数,迁移率=(迁移终点细胞数-迁移起点细胞数)/迁移起点细胞数×100%。

1.2.6蛋白免疫印迹法检测HL-60细胞中PI3K/AKT信号通路及EMT相关因子及表达水平 转染HL-60细胞24 h后,采用RIPA裂解液重悬并裂解;在4 ℃条件下,以12 000 r/min离心10 min,然后收集上清液,即总蛋白样品。将蛋白样品进行凝胶电泳(80～120 V恒压法),再采用电泳法(300 mA恒流法)进行蛋白转膜,利用脱脂牛奶法进行膜封闭,在4 ℃条件下进行一抗孵育过夜;室温二抗孵育2 h。封闭、一抗孵育、二抗孵育和显影之间分别用Tris洗膜缓冲液进行3～5次膜洗涤。在凝胶成像系统中进行图片采集,并用ImageJ V1.8.0软件进行蛋白灰度分析,内部参考为β-actin,并进行目的蛋白相对表达水平的计算。

2 结 果

2.15组miR-186相对表达水平比较 对照组、mimic NC组、miR-186组、miR-186+抑制剂组、miR-186+激活剂组的miR-186相对表达水平分别为1.00±0.17、1.01±0.19、1.85±0.14、1.85±0.14、1.82±0.15。5组间miR-186相对表达水平比较,差异有统计学意义(F=24.783,P<0.05);与mimic NC组相比,miR-186组miR-186表达水平升高(t=6.463,P<0.05)。miR-186组与miR-186+抑制剂组和miR-186+激活剂组的miR-186相对表达水平比较,差异均无统计学意义(t=0.023、0.231,P>0.05)。见图1。

图1 5组miR-186相对表达水平

2.25组HL-60细胞的增殖率比较 对照组、mimic NC组、miR-186组、miR-186+抑制剂组、miR-186+激活剂组细胞增殖率分别为(58.63±3.36)%、(59.07±3.69)%、(34.6±2.23)%、(20.53±1.86)%、(57.5±2.91)%。5组HL-60细胞的增殖率比较,差异有统计学意义(F=111.339,P<0.05)。与mimic NC组相比,miR-186组细胞增殖率降低(t=10.364,P<0.05)。与miR-186组相比,miR-186+抑制剂组细胞增殖率降低(t=5.959,P<0.05),而miR-186+激活剂组细胞增殖率升高(t=9.699,P<0.05)。见图2、3。

图2 5组HL-60细胞增殖情况

图3 5组HL-60细胞增殖率

2.35组HL-60细胞的迁移率比较 对照组、mimic NC组、miR-186组、miR-186+抑制剂组、miR-186+激活剂组细胞迁移率分别为(21.00±2.09)%、(20.88±2.53)%、(9.73±0.44)%、(6.03±0.45)%、(20.88±2.43)%。5组HL-60细胞的迁移率比较,差异有统计学意义(F=46.332,P<0.05)。与mimic NC组相比,miR-186组细胞迁移率降低(t=7.391,P<0.05)。与miR-186组相比,miR-186+抑制剂组细胞迁移率降低(t=2.453,P<0.05),而miR-186+激活剂组细胞迁移率升高(t=7.391,P<0.05)。见图4。

图4 5组HL-60细胞迁移率

2.45组HL-60细胞中EMT相关因子及其mRNA相对表达水平比较 5组HL-60细胞中EMT相关因子及其mRNA相对表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与mimic NC组相比,miR-186组E-cadherin及其 mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-186组相比,miR-186+抑制剂组E-cadherin 及其mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与miR-186组相比,miR-186+激活剂组E-cadherin 及其mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5、表2、3。

图5 HL-60细胞中EMT相关因子的表达

表2 5组HL-60细胞中EMT相关因子相对表达水平比较

表3 5组HL-60细胞中EMT相关因子mRNA相对表达水平比较

2.55组HL-60细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平比较 5组HL-60细胞中PI3K/AKT信号通路p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与mimic NC组相比,miR-186组p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-186组相比,miR-186+抑制剂组p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-186+激活剂组p-PI3K和p-AKT蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4、图6。

图6 HL-60细胞PI3K/AKT通路相关蛋白的表达

表4 5组HL-60细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平比较

3 讨 论

急性髓系白血病属于髓系增生性肿瘤,具有克隆性髓系祖细胞分化为成熟血细胞过程中受抑制及多系细胞减少的典型特征,特点是高异质性、高病死率。因而研究急性髓系白血病相关分子机制对该疾病治疗意义重大[13-14]。miRNA参与多种肿瘤细胞生长、分化和转移等生物学行为过程。在真核生物中由于miRNA表达水平稳定且易检测,越来越多的miRNA逐渐成为判断急性髓系白血病发生、发展和预后等方面的标志物。有研究表明,miRNA家族成员之一的miR-186,参与靶向调控多种基因,在胃癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等不同肿瘤中miR-186表达水平均下降,miR-186参与抑制细胞增殖、迁移和侵袭等过程[15-17]。CUI等[18]研究表明,miR-186能够在非小细胞肺癌的增殖和转移过程中起到抑制作用。在慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病患者中miR-186表达水平下降[19]。但具体关于miR-186与急性髓系白血病作用机制的报道较少见。本研究结果显示,miR-186组HL-60细胞增殖率和迁移率低于mimic NC组,差异均有统计学意义(P<0.05),提示miR-186对HL-60细胞有抑制增殖和迁移的作用,说明miR-186可有效抑制急性髓系白血病的发生、发展,这一结果也与miR-186在前列腺癌中的表达结果相似[20]。

PI3K/AKT通路在肿瘤细胞发生进程中具有重要调控作用,激活PI3K/AKT通路,可以促进细胞的增殖与转移。DONG等[15]在软骨细胞中的研究显示miR-186可以调控PI3K/AKT信号通路,付民等[11]在肺腺癌中的研究也同样显示肿瘤细胞的增殖与迁移受miR-186激活PI3K/AKT通路的影响。本研究结果发现,miR-186组p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平低于mimic NC组,差异均有统计学意义(P<0.05),提示miR-186过表达可以显著降低HL-60细胞p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平,这与高平章等[21]对PI3K/AKT通路与HL-60细胞的研究结果相似。本研究发现,miR-186+抑制剂组HL-60细胞增殖率、迁移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平低于miR-186组,miR-186+激活剂组HL-60细胞增殖率、迁移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平高于miR-186组,差异均有统计学意义(P<0.05),提示随着PI3K/AKT通路抑制剂的加入,HL-60细胞增殖率、迁移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平降低,而加入PI3K/AKT通路激活剂后,则与抑制剂组有相反的趋势,表明HL-60细胞进程受抑制的作用机制与miR-186对PI3K/AKT通路的阻遏有关。

肿瘤细胞经过EMT获得间质表型进而具备转移能力等参与肿瘤进程[22],EMT的调控是一个复杂的网络机制,多种信号通路涉及其中,如核转录因子-κB(NF-κB)、PI3K/AKT、Janus激酶2(JAK2)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)等。miRNA在肿瘤的发生及转移中起重要作用。李京辉等[23]在对胰腺癌细胞的研究中发现miR-490-3p可以通过抑制EMT进程,进而影响肿瘤细胞的发生、发展。ZHOU等[24]研究表明,miR-148a-3p可以通过调控EMT进而抑制急性髓系白血病的进程。肿瘤细胞恶性增殖及迁移是肿瘤转移的重要原因,而肿瘤细胞EMT则是肿瘤转移的早期标志。本研究中,miR-186组E-cadherin及其 mRNA表达水平高于mimic NC组,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表达水平低于mimic NC组,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-186+抑制剂组E-cadherin 及其mRNA表达水平高于miR-186组,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表达水平低于miR-186组,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-186+激活剂组E-cadherin 及其mRNA表达水平低于miR-186组,差异均有统计学意义(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表达水平高于miR-186组,差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示miR-186抑制了HL-60细胞EMT进程,在加入PI3K/AKT信号通路抑制剂后,E-cadherin及其mRNA表达水平进一步升高,N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表达水平降低,而激活剂组则与抑制剂组有相反的趋势。这说明miR-186通过阻遏PI3K/AKT信号通路抑制HL-60细胞EMT进程,从而影响HL-60细胞的增殖与迁移,这与付民等[11]在肺腺癌中的研究结果相似,揭示miR-186能够通过阻遏PI3K/AKT通路来抑制肿瘤细胞的EMT,进而抑制细胞增殖和迁移。

综上所述,miR-186过表达可通过阻遏PI3K/AKT信号通路,抑制HL-60细胞EMT,进而抑制HL-60细胞增殖和迁移,本研究为以miR-186为靶点开发新药治疗急性髓系白血病提供理论基础,但miR-186对HL-60细胞的增殖、迁移及EMT进程影响是否与其他机制有关需进一步深入研究。