蓖麻RcNFYA3-1基因的克隆及表达分析

杨跃超，吕世友，何智彪，范慕博，张童劼，张继星

（1.内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028043；2.内蒙古自治区蓖麻产业协同创新中心，内蒙古 通辽 028043；3.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062；4.通辽市农牧科学研究所，内蒙古 通辽 028015；5.内蒙古民族大学农学院，内蒙古 通辽 028043）

转录因子属于DNA结合蛋白，是植物中最重要的一种调节因子［1］。转录因子能够识别上游基因的顺式作用元件，同时，可以把细胞表面的信息传至细胞核［2］，在植物逆境胁迫中发挥着一定的作用［3］。转录因子NF-Y，也称为CCAAT 结合因子，是一种异三聚体转录因子，具有高度保守的核心序列CCAAT［4］。NF-Y 因子包含NF-YA、NF-YB 和NF-YC 等3 个部分［5］，NF-Y 的每个亚基都由多个相似序列编码［6］。NF-YA、NF-YB 和NF-YC 各自广泛参与植物胚胎和种子发育、胁迫反应、ABA 信号、固氮、根系伸长、植物与微生物相互作用等过程［7-12］。

NFYAs包含2个结构域，是NF-Y最为重要的亚基，其中一个结构域能够在N端与NFYB和NFYC相互作用，另一个能够在C端结合DNA［13］。其中，NFYB与NFYC能够组合形成二聚体，并识别CCAAT-box，最终与NFYA形成三聚体，使DNA结构更松散，进而更有效结合到RNA聚合酶［14］。NF-YA转录因子的家族成员也是microRNA169转录后调控的靶标之一［15］。microRNA是一种不参与编码的RNA，参与调节基因的表达［16］。一般来说，由于NFYAs在3′UTR区域大多存在一段miR169的互补位点，植物miRNA可通过切割mRNA 或者在翻译水平来负调控基因的表达［17］。miR169/NF-YA 能够被细胞内信息及外界条件激活，使植物对周围环境改变的适应性提高［18］。拟南芥NFYAs的成员大多都有与miR169互补的保守序列［19］。玉米共有14 个NFYAs 成员，miR169 可以切割8 个NFYAS成员［20］；油菜中miR169 能够切割12 个NFYAs成员［21］；葡萄中miR169可以切割21个NFYAs成员［22］；此外，水稻［23］、大豆［24］和日本杏［25］中也有相关报道。

蓖麻是大戟科蓖麻属草本植物［26］，集中分布在热带地区或热带至暖温带地区，适宜高温，广泛种植于我国。蓖麻的应用广泛，具有极高的利用价值，已受到越来越多的关注［27］。蓖麻根系发达，具有防风固沙作用。蓖麻能够改良盐碱地，缓解因土地沙化等造成耕地面积减少的问题［28］。内蒙古通辽市土壤盐碱化现象比较普遍，该地区是蓖麻种植的主要产区，而盐胁迫是限制该地区蓖麻产量的主要因素之一。笔者克隆了蓖麻NFYA3-1基因，并分析基因的表达模式，为深入研究蓖麻RcNFYA3-1基因的生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为“哲蓖三号”，该品种来自通辽市农牧科学研究所。

1.2 蓖麻总RNA提取及cDNA合成

将大小一致的种子均匀地摆放在发芽盒中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、相对湿度70%～75%的光照培养箱中培养，至4叶龄。用200 mmol/L NaCl 处理0、2、6、8、12、24 h，分别取根、茎、叶，立即放于液氮，在-80 ℃冰箱备用。采用Trizol法提取蓖麻总RNA，并进行电泳检测。

1.3 蓖麻NFYA3基因克隆

反转录获得模板cDNA，RcNFYA3-1的上游引物和下游引物（表1）由prime primer5软件设计，加入载体的酶切位点。进行PCR扩增反应（表2），使用康为世纪Gel Extraction Kit试剂盒对目的条带进行回收，连接pMDTM19-T Simple Vector，并转入大肠杆菌感受态中。经阳性菌株筛选后进行菌液PCR，检测成功后测序。

表1 PCR所用引物序列Tab. 1 Primer sequences used for PCR

表2 PCR反应条件Tab. 2 PCR reaction conditions

1.4 生物信息学分析

对RcNFYA3-1进行生物信息学分析所用的工具见表3。

表3 生物信息学分析所用相关网站、在线软件Tab. 3 Relevant websites and online software for bioinformatics analysis

1.5 植物表达载体构建

测序正确的菌株进行扩增培养并提质粒，对重组质粒进行双酶切（表4）。与PCHF-3300 进行连接（表5），将连接产物转到大肠杆菌中，培养并进行扩摇，对扩摇后的菌液进行PCR检测，对阳性菌进行双酶切鉴定。

表4 酶切体系Tab. 4 Enzymatic system

表5 连接体系Tab. 5 Ligation system

1.6 RcNFYA3-1基因的表达分析

以测序得到的RcNFYA3-1序列，通过NCBI设计荧光定量引物（表1）。RcADP和RcSKIP作为内参基因，进行不同盐处理下蓖麻根、茎和叶中RcNFYA3-1表达量的测定，反应条件见表6。实验设置3次重复，2-ΔΔCT计算基因相对表达量［29］。

表6 qRT-PCR反应程序Tab. 6 qRT-PCR reaction procedure

2 结果与分析

2.1 RcNFYA3-1全长的获得与序列分析

蓖麻总RNA经反转录得到cDNA，扩增得到NFYA3-1基因，扩增产物大小为984 bp（图1），编码327个氨基酸（图2）。RcNFYA3-1蛋白保守区由NCBI预测（图3）。结果表明，蓖麻RcNFYA3-1基因有一个CCAAT框架结合转录因子（CBFB-NFYA）保守结构域，位于氨基酸位点183～237处。利用DNAMAN软件对蓖麻RcNFYA3-1氨基酸进行比对，6种植物中一致性较高（图4）。分别为木薯、山靛、巴西橡胶树、开心果、麻风树、胡杨。RcNFYA3-1的氨基酸序列与木薯、山靛、巴西橡胶树、开心果、麻风树、胡杨的氨基酸序列相似度超过50%，与木薯的相似度最高，为68.77%。

图1 PCR扩增产物Fig. 1 PCR products

图2 RcNFYA3-1 基因核苷酸及氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and amino acid sequences of RcNFYA3-1 gene

图3 RcNFYA3-1蛋白保守结构域Fig. 3 Conserved structural domains of RcNFYA3-1 protein

图4 NFYA基因家族多序列比对Fig. 4 Multiple sequence comparison of the NFYA gene family

2.2 RcNFYA3-1理化性质和蛋白结构分析

通过ExPASy 得到RcNFYA3-1蛋白的理化性质，该蛋白编码327个氨基酸残基，编码蛋白质的相对分子质量为36.093 kD，原子总数为4984个；蛋白质由18种氨基酸组成，其中，丝氨酸的数量最多，PI值为9.22。NFYA3-1蛋白的二级结构通过SOPMA预测（图5），该蛋白质的无规则卷曲占比最高为66.67%，α螺旋为17.13%、延伸链为11.39%以及β-折叠为4.28%；利用SWISS-Model进行三级结构预测（图6）。通过TMHMM分析RcNFYA3-1蛋白的跨膜结构（图7），该蛋白氨基酸都存在于细胞膜表面，是一种典型的非跨膜蛋白。利用DNAMAN软件进行的蛋白质亲水性分析结果表明，NFYA3-1编码的蛋白质亲水区较大，推测该蛋白为亲水性蛋白（图8）。

图5 RcNFYA3-1蛋白的二级结构Fig. 5 Secondary structure of the RcNFYA3-1 protein

图6 RcNFYA3-1蛋白三维结构Fig. 6 Three-dimensional structure of RcNFYA3-1 protein

图7 RcNFYA3-1蛋白跨膜结构Fig. 7 Transmembrane structure of RcNFYA3-1 protein

图8 RcNFYA3-1蛋白亲水性、疏水性分析Fig. 8 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of RcNFYA3-1 protein

2.3 RcNFYA3-1表达载体构建

对重组质粒进行电泳检测（图9），经酶切的表达载体条带远小于重组质粒，且目的条带与RcNFYA3-1序列大小相同（图10），表明表达载体构建成功。

图9 质粒电泳检测Fig. 9 Plasmid electro phoresis detection

图10 质粒酶切检测Fig. 10 Plasmid digestion detection

2.4 RcNFYA3-1盐胁迫下表达分析

RcNFYA3-1盐处理后的基因表达量显示，蓖麻RcNFYA3-1基因主要在根中表达，在8 h达到最高，在12 h时差异显著；茎中的表达量在2 h时达到最高，且差异极显著；叶的表达量在12 h时最高，超过其他时间点的表达量且差异显著（图11）。

图11 RcNFYA3-1表达量的测定Fig. 11 Determination of the expression of RcNFYA3-1

3 讨论与结论

从蓖麻中克隆得到转录因子RcNFYA3-1基因，构建RcNFYA3-1过表达载体，并进行生物信息学分析。结果显示，蓖麻RcNFYA3-1的氨基酸序列与木薯等5种植物的氨基酸序列高度一致。RcNFYA3-1是一种亲水性蛋白质，没有跨膜结构域。RcNFYA3-1基因序列分析发现，RcNFYA3-1基因有CCAAT框结合转录因子（CBFB-NFYA）保守结构域。

通常情况下，植物在应对不利环境过程中形成了复杂抗逆机制。在植物中，NF-Y 因子既参与植物的生长和发育过程［30-31］，也参与植物逆境胁迫［32］。RcNFYA3-1作为核转录因子，同时也是miRNA-169家族成员的靶基因，在植物耐盐碱中可能扮演着重要的角色。本研究结果表明，NFYA基因家族中多个成员参与盐胁迫的调控。NI等［14］过表达GmNFYA3能够明显增加GmNFYA3转基因拟南芥的耐旱性，同时，相比于野生型表现出对盐更敏感。一项关于大白菜的BpNFYA5研究发现，在干旱环境下，过表达BpNFYA5能够增加脯氨酸的含量，从而增加植株的耐旱性［33］。此外，在拟南芥中过表达miRNA-169，结果导致AtNFYA2、AtNFYA3和AtNFYA8的表达量降低，使植株对氮的响应能力改变［34］。水稻OsmiR169基因在应对盐胁迫时高度表达，并通过靶向和抑制特定OsNF-Ya基因家族mRNA的表达来消除ABA信号的阻断，从而产生对盐胁迫的抗性响应，使植物存活下来［35］。

本研究经qRT-PCR分析，蓖麻RcNFYA3-1基因存在组织特异性，该基因极大可能在盐胁迫下在蓖麻中发挥作用，但具体调控机制仍需进一步探索。