华蟾素通过调控M2型巨噬细胞极化抑制结直肠癌转移

尚 靖,王 云,陈进宝,唐东豪,贾琳琳,李 炜,于宏杰

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道肿瘤,发病率在世界范围内呈上升趋势[1]。肿瘤转移是CRC患者死亡的主要原因[2-3]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的主要组成部分,通常表现为促肿瘤的M2样表型,与肿瘤转移密切相关[4-5]。华蟾素是干蟾皮提取物,目前广泛应用于抗恶性肿瘤治疗,对多种癌症均有明显的治疗作用。研究[6]显示华蟾素可以通过调节M2型TAMs的极化发挥抗肿瘤作用。因此,该研究旨在探索华蟾素能否通过调控M2型巨噬细胞极化进而发挥抑制结直肠癌转移的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂RPMI-1640培养基、双抗(青霉素/链霉素)溶液和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)购自美国Sigma公司;CD11b-PE抗体和CD206-FITC抗体购自美国BD Pharmingen公司;RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒购自扬州艾瑞克生物科技有限公司;白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司;华蟾素注射液(国药准字Z34020273)购自淮北华润金蟾药业股份有限公司;CCK-8试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司;BD Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 细胞培养RPMI-1640完全培养基(含10%FBS和1%双抗)培养人结直肠癌细胞HCT116和人单核细胞白血病细胞THP-1,在含有5% CO2的37 ℃恒温恒湿培养箱中培养。

1.3 条件培养基(conditioned medium,CM)将HCT116细胞培养基更换为无血清RPMI-1640培养基,48 h后获得CMHCT116;用华蟾素处理HCT116细胞24 h后,更换为无血清RPMI-1640培养基,48 h后获得CMHCT116+华蟾素;THP-1细胞用RPMI-1640完全培养基(含400 ng PMA)培养48 h获得贴壁的M0细胞;用CMHCT116和CMHCT116+华蟾素分别处理M0细胞48 h后,获得HCT116-Mφ细胞和(HCT116+华蟾素)-Mφ细胞;将培养基更换为无血清RPMI-1640培养基,48 h后分别获得CMHCT116-Mφ和CM(HCT116+华蟾素)-Mφ;CM用0.22 μm滤器过滤,存放在-20 ℃冰箱备用。

1.4 流式细胞术M0细胞用不同CM(含10% FBS)培养48 h并收集,取1×106个细胞,加入CD11b-PE抗体和CD206-FITC抗体各10 μl,室温避光孵育25 min后,用流式仪器检测。

1.5 RT-qPCRM0细胞用不同CM(含10% FBS)培养48 h,提取细胞总RNA,逆转录获得cDNA,通过RT-qPCR反应,以β-actin作为内参,用2-ΔΔCt法计算IL-10和TGF-β的相对表达水平,引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 ELISAM0细胞用不同CM(含10% FBS)培养48 h,收集CM,用ELISA试剂盒检测IL-10和TGF-β水平。酶标板孔加100 μl样品,37 ℃、90 min;加抗体,37 ℃、60 min;加亲和素-过氧化物酶复合物,37 ℃、30 min;加显色液,37 ℃、25 min;加终止液,在450 nm处测吸光度。

1.7 划痕实验HCT116细胞接种于12孔板(5×105个),待细胞汇合,用枪头划出直线,PBS清洗,加入CM,分别于0 h和24 h拍照,用ImageJ软件分析实验结果。

1.8 迁移实验HCT116细胞接种于6孔板(4×105个),培养过夜,用CM(含10% FBS)培养48 h,收集细胞并用无血清RPMI-1640培养基重悬,上室加入2×104个细胞,下室加入700 μl含20% FBS的RPMI-1640培养基,48 h后进行固定、结晶紫染色、清洗和拍照,用ImageJ软件分析实验结果。

1.9 侵袭实验预先用基质胶包被Transwell上室的底膜,并按照1.8的方法完成侵袭实验。

1.10 CCK-8实验HCT116细胞接种于96孔板(1.5×104个),培养过夜,用含不同浓度华蟾素的新鲜培养基刺激24 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μl,孵育30 min后在450 nm处检测吸光度值。

2 结果

2.1 HCT116细胞使M0细胞形态发生变化用THP-1细胞经过PMA刺激后获得贴壁的M0细胞,M0细胞经过CMHCT116刺激48 h获得HCT116-Mφ细胞,形态变为梭形贴壁细胞(图1)。

图1 HCT116细胞使M0细胞形态发生变化 ×200

2.2 HCT116细胞促进M2型巨噬细胞极化为了观察HCT116细胞对M2型巨噬细胞极化的影响,用CMHCT116刺激M0细胞48 h获得HCT116-Mφ细胞,收集细胞进行流式实验和RT-qPCR实验,收集上清液进行ELISA实验。流式实验结果如图2A所示,与M0相比,HCT116-Mφ细胞中CD11b+CD206+细胞(M2型巨噬细胞)比例明显上升(t=14.85,P<0.001)。RT-qPCR实验结果如图2B所示,与M0相比,HCT116-Mφ细胞中M2型巨噬细胞的生物标志物IL-10和TGF-β的mRNA水平明显升高(tIL-10=10.27,tTGF-β=8.694,P<0.001)。ELISA实验(图2C)也进一步验证了该结果(tIL-10=7.072,tTGF-β=7.085,P<0.01)。以上结果表明HCT116细胞可以促进M2型巨噬细胞极化。

图2 HCT116细胞促进M2型巨噬细胞极化

2.3 M2型巨噬细胞促进HCT116细胞转移为了观察M2型巨噬细胞对HCT116细胞转移能力的影响,分别收集CMM0和CMHCT116-Mφ,刺激HCT116细胞后进行划痕实验和Transwell实验。划痕实验结果如图3A所示,与CMM0组相比,CMHCT116-Mφ处理的HCT116细胞的平均划痕愈合率明显升高(t=5.367,P<0.01)。Transwell迁移实验(图3B)也验证了M2型巨噬细胞促进HCT116细胞迁移能力(t=9.871,P<0.001)。Transwell侵袭实验结果如图3C所示,与CMM0组相比,CMHCT116-Mφ处理的HCT116细胞发生侵袭的细胞数目明显增多(t=8.557,P<0.01)。这些结果表明M2型巨噬细胞可以促进HCT116细胞转移。

图3 M2型巨噬细胞促进HCT116细胞转移 ×100

2.4 华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞极化为了研究华蟾素对M2型巨噬细胞极化的影响,选用非杀伤浓度 5 mg/ml(图 4A)作为干预浓度。流式实验结果如图4B,与HCT116-Mφ细胞相比,(HCT116+华蟾素)-Mφ细胞中CD11b+CD206+细胞(M2型巨噬细胞)比例明显下降(t=4.151,P<0.05)。RT-qPCR实验结果如图4C,与HCT116-Mφ细胞相比,(HCT116+华蟾素)-Mφ细胞中M2型巨噬细胞的生物标志物IL-10和TGF-β的mRNA水平明显下降(tIL-10=11.88,tTGF-β=14.15,P<0.001)。ELISA实验(图4D)也具有同样的趋势(tIL-10=7.09,tTGF-β=5.567,P<0.01)。以上结果表明华蟾素可以抑制HCT116细胞介导的M2型巨噬细胞极化。

图4 华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞极化

2.5 华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞介导的HCT116细胞转移分别收集CMHCT116-Mφ和CM(HCT116+华蟾素)-Mφ,刺激HCT116细胞后进行划痕实验和Transwell实验。划痕实验结果如图5A所示,与CMHCT116-Mφ组相比,CM(HCT116+华蟾素)-Mφ处理的HCT116细胞的平均划痕愈合率明显下降(t=3.8,P<0.05)。Transwell迁移实验(图5B)亦有同样趋势(t=3.505,P<0.05)。Transwell侵袭实验结果如图5C所示,与CMHCT116-Mφ组相比,CM(HCT116+华蟾素)-Mφ处理的HCT116细胞发生侵袭的细胞数目明显减少(t=3.540,P<0.05)。这些结果表明华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞介导的HCT116细胞转移。

图5 华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞介导的HCT116细胞转移 ×100

3 讨论

越来越多的证据[7]表明,TAMs作为TME中丰富且活跃的浸润性炎症细胞,不仅在CRC的生长和转移中起着至关重要的作用,而且与患者的预后不良密切相关。TAMs可以极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞可以通过产生促炎细胞因子和激活肿瘤免疫反应发挥抗肿瘤作用,M2型巨噬细胞通过促进血管生成、产生免疫抑制效应、诱导乏氧TME、促进肿瘤细胞增殖和转移发挥促肿瘤作用,而TAMs通常被肿瘤细胞诱导极化为M2型巨噬细胞。例如,Cai et al[8]研究发现,TAMs分泌的TGF-β一旦在与CRC细胞上的受体结合,就会激活Smads/Snail信号通路,促进CRC的上皮间充质转化进程,从而促进转移。不仅如此,TAMs还通过促进肿瘤细胞内渗进入血管、促进血液循环中的肿瘤细胞存活、促进肿瘤外渗迁移到血管外组织和参与转移前生态位的形成等方式,促进肿瘤转移和侵袭[9-10]。本研究用CMHCT116刺激M0巨噬细胞后,得到梭形的HCT116-Mφ细胞,流式细胞术检测显示HCT116-Mφ细胞中的CD11b+CD206+细胞比例明显增多,PCR和ELISA实验显示HCT116-Mφ细胞中IL-10和TGF-β的水平明显升高,表明HCT116细胞能促进M2型巨噬细胞极化。用CMM0和CMHCT116-Mφ刺激HCT116细胞后进行的划痕实验和Transwell实验表明,M2型巨噬细胞能显著提高HCT116细胞的转移能力。

中医药作为治疗CRC的有效手段之一,在改善手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗引起的毒副作用的同时,可以通过抑制增殖、诱导凋亡、促进自噬、抑制血管生成等途径发挥抗肿瘤作用,并延长患者的生存时间[11]。此外,中医药还能通过调节TME发挥抗肿瘤作用,例如调节TAMs的极化。华蟾素作为传统中药,已广泛用于癌症治疗和基础研究,包括CRC[12-14]。Wang et al[15]研究表明华蟾素在体外可以有效抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,在体内可以有效抑制肿瘤转移,其机制可能与抑制上皮间质转化和抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。本研究进一步探索了华蟾素是否通过调节M2型巨噬细胞极化来抑制转移,通过流式细胞术、PCR和ELISA实验表明华蟾素能明显抑制M2型巨噬细胞极化。并通过划痕和Transwell实验表明,华蟾素可以抑制M2型巨噬细胞介导的HCT116细胞转移。