运用孟德尔随机化探索肠道微生物与非酒精性脂肪性肝病的因果关联

吴 闵,安祯祥,2,何远利,3,何 松,2,刘 闯,2,孙 凯,2

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是临床慢性肝病常见的病因,在没有过量饮酒或其他慢性肝病的情况下,有5%以上肝细胞中有脂肪变性的存在,与代谢风险相关[1],并且是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。NAFLD给患者带来了沉重的负担,损害了与健康相关的生活质量和工作效率。目前NAFLD的发病机制尚不清楚,但肠道微生物组与NAFLD发病有着重要关系。当下还没有明确NAFLD的治疗方法,有研究[2]表明,肠道组织可以通过肠-肝轴途径来参与NAFLD疾病的发生发展,通过调控肠道微生物改善NAFLD患者肝脏表型。尽管肠道微生物群与NAFLD密切相关,但是其因果关系难以捉摸。孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)是一种统计分析方法,主要采用遗传变异为工具变量,观察关联结果推断潜在的因果关系[3]。该研究采用孟德尔随机化的思想,探讨肠道微生物不同菌群之间与NAFLD风险的潜在因果关系。

1 材料与方法

1.1 研究设计采用两样本孟德尔随机化分析肠道微生物与NAFLD之间的因果关系。以肠道微生物为暴露因素,包含211种肠道细菌性状,结局变量为NAFLD。

1.2 数据来源使用的肠道微生物数据来自于一项多个国家的全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS),该研究纳入了24个队列,18 340 例受试者,分别来自美国、加拿大、以色列、荷兰、比利时、瑞典、韩国、德国、丹麦、芬兰和英国,对他们进行基因测序谱和基因分型数据,通过调整年龄、性别、技术及遗传主成分等探索肠道微生物与人类染色体遗传变异之间的关系,课题组在5个水平(门、纲、目、科和属)评估了211个肠道微生物群分类群。该研究基于16S rRNA基因的3个不同可变区(V4、V3-V4和V1-V2)分析了肠道微生物群的组成,并使用微生物群数量性状基因座(microbiome quantitative trait loci,mbQTL)作图来鉴定影响微生物分类群相对丰度的遗传变体[4]。NAFLD基因结果关联的数据来自FinnGen数据库,包括894例NAFLD病例,217 898例对照。使用数据集来源详见表1。

表1 全基因组关联研究的细节与分析中使用的数据集

1.3 两样本孟德尔随机化的假设为了保证暴露因素与结局指标之间因果关系的真实性和准确性,MR必须符合3个重要假设： ① 工具变量(single nucleotide polymorphism,SNP)与暴露因素肠道菌群强相关联。② 工具变量SNP与结局变量NAFLD之间和其他混杂因素没有关联,即排除如肥胖、体重指数(body mass index,BMI)、自身免疫性疾病等混杂因素。③ 工具变量SNP仅通过影响暴露因素肠道微生物对结局变量NAFLD产生影响,不能通过其他途径对NAFLD造成影响。F统计量一般用于评估工具变量与暴露之间的相关性强度。F统计量的计算公式为：

F应>10,如果F<10,则说明工具变量与暴露之间的关联较弱。

1.4 工具变量选择与肠道微生物组明显相关的SNPs作为工具变量,参照千个全基因组项目的全基因组信息,将全基因组统计显著性阈值参数设置为P<5×10-8。将连锁不平衡参数设置为r2<0.001,聚集距离=10 000 kb,从肠道微生物数据中挑选出无连锁效应的SNP,再从已选出的SNP中剔除与NAFLD有意义的SNP(P<0.05),系统收集SNPs的主要信息,包括效应等位基因、其他等位基因、β、SE和P值,用于进一步分析[5]。

1.5 孟德尔随机化分析孟德尔随机化方法是一种基于遗传变异的随机化方法,用于评估因果关系。它利用自然界中存在的基因变异,将个体分为不同的基因型,从而模拟随机化试验的效果,以评估某个因素对某种疾病的影响是否具有因果性。这种方法可以避免传统流行病学研究中的混杂因素和反向因果关系,从而提高因果推断的可信度。常使用包括逆方差加权(inverse-variance weighted,IVW)、MR-Egger、加权中位数法(weighted median, WM)、Simple Mode法、Weighted Mode法在内的高效统计方法来推断人类肠道微生物组对NAFLD风险是否存在因果效应。使用IVW方法作为主要分析,因为它提供了最精确的效应估计,几乎所有MR分析都将其作为主要分析。采用MR-Egger回归检验潜在的水平多效性,如果截距的P<0.05,则可能存在SNP的水平多效性。MR-PRESSO检测多效性偏差的异常值并纠正水平多效性。此外,Cochran的Q统计量用于量化所选SNP之间的异质性。为确定是否存在潜在的强影响SNP,采用留一敏感度分析法验证因果效应估计的可靠性和稳定性。使用R软件(版本4.0.2,TwoSampleMR、MR-PRESSO包)进行统计分析。

2 结果

2.1 孟德尔随机化分析结果IVW分析结果表明,丙型变形菌纲(OR=0.621,95%CI=0.412～0.934,P=0.022)、普氏菌属7(OR=0.834,95%CI=0.714～0.974,P=0.021)、脱硫弧菌目(OR=0.714,95%CI=0.519～0.982,P=0.038)3种肠道细菌性状与NAFLD风险负相关。肠杆菌科(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)、毛螺菌科(OR=1.405,95%CI=1.036～1.904,P=0.029)、普氏菌属9(OR=1.251,95%CI=1.025～1.527,P=0.027)、肠杆菌目(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)4种肠道细菌性状与NAFLD风险正相关。并且筛选出来SNP的F均>10,说明工具变量与暴露之间存在较强的关联。考虑到NAFLD易受生活方式、饮酒的影响,本实验使用PhenoScanner查询了阳性结果的SNP,并排除了与上述混杂因素相关的SNP。详见表2。IVW结果森林图见图1。

图1 IVW结果森林图

表2 孟德尔随机化分析主要结果

2.2 敏感性分析Cochran Q检验结果显示7种肠道细菌性状Cochran Q检验P均>0.05,提示SNP间不存在异质性;多效性分析MR-Egger结果显示7种肠道细菌性状的P值均>0.05,因此,以上肠道细菌性状不存在多效性水平的情况。本研究的敏感性分析采用Leave-one-out检验并绘制图,留一图表明在去除其中任何一个SNP,剩下的SNPs均在无效线的同一侧,去掉任何一个SNP后对结果产生的影响均较小,则提示该MR研究结果比较稳健。散点图则提示7种肠道菌群不同的统计方法的趋势基本一致,说明其偏差较小。漏斗图显示IVW左右两边的点大致对称,说明发病偏移较小。敏感性分析见表3,留一图见图2,散点图见图3,漏斗图见图4。

图2 两样本MR结果留一图

图3 两样本MR结果散点图

图4 两样本MR结果漏斗图

表3 敏感性分析

3 讨论

本研究采用两样本孟德尔随机化方法对211种肠道细菌性状与NAFLD的GWAS数据进行因果关联分析,共确定了7种细菌性状与NAFLD存在因果关系,其中丙型变形菌纲、普氏菌属7、脱硫弧菌目3种细菌性状与NAFLD的风险成负相关,肠杆菌科、毛螺菌科、普氏菌属9、肠杆菌目4种肠道细菌性状是NAFLD发病的风险因素。

人类身体的胃肠道黏膜表面被数以万计的肠道微生物所定植,这些肠道微生物组参与宿主免疫系统的调节和维持。因肠道微生物群的差异,涉及了免疫、能量、脂质和葡萄糖代谢等多种途径,并参与了全身多种疾病的发生。近年来肠道微生物组在NAFLD中得到了广泛的研究,有证据[6]表明,肠道微生物组-肝脏轴在NAFLD中发生作用,尤其是在纤维化和进展到晚期的疾病阶段,并且该研究证明肠道微生物组中肠杆菌科的改变会影响NAFLD疾病的发展。

丙型变形菌纲是肠道微生物主要类之一,丙型变形菌纲与NAFLD等疾病有关[7],并且在NAFLD中丙型变形菌纲丰度增加。普氏菌属是常见且丰富的专性厌氧菌,该属的成员属于胃肠道和呼吸道的微生物群落,并与糖尿病、心血管疾病和NAFLD等疾病高度相关,其共同特征是低度全身炎症[8]。在非糖尿病队列中[9],普氏菌属丰度增加可能与胰岛素抵抗有关。有研究[7]指出,患有NAFLD的儿童携带的普氏菌属丰度较健康儿童高。并且使用富含普氏菌属的生态失调微生物群从具有缺陷的炎症小体途径的小鼠转移到野生型小鼠中,研究富含普氏菌属的生态失调在NAFLD和肥胖中的作用,且该菌还加剧了蛋氨酸胆碱缺乏型饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎,使肝脏脂肪变性和炎症增加以及肝功异常[10]。而另一项研究[11]则提示普氏菌属丰度水平的降低可能对患有NAFLD的成年人有害,但毛螺菌科水平升高可能是NAFLD疾病进展的主要因素。肠道微生物中肠杆菌科是变形杆菌门的重要成员,该菌群包括许多已知在哺乳动物的大肠和小肠中定植,并且在NAFLD及结直肠癌中该细菌水平升高[12]。脱硫弧菌目菌多与神经类疾病[13]、消化系统疾病密切相关[14]。而在NAFLD疾病中脱硫弧菌目菌与瘦的NAFLD患者成负相关,与肥胖NAFLD患者呈正相关,两者表现出相反的趋势,但与总NAFLD呈负相关[15]。这说明肠道微生物群与疾病的发生密切相关,尤其是肠内外疾病,但其对肠内外疾病产生有益或有害作用的机制仍有待进一步研究。

虽然本研究分析了肠道微生物群,但肠道微生物群太大且异质,因此数据有限;其次,本研究虽然单独分析了肠道微生物群与NAFLD之间的遗传因果关系,但未进一步探索肠道微生物与NAFLD之间的生物学关系。