GNB4和Riplet基因甲基化检测在原发性肝癌诊断中的价值研究

杨玉萍,徐恩君,汪轩轩,唐宜桂,郑美娟,王 悦,储梦真,徐家丹,王中新

原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,是慢性肝脏疾病患者最常见的死因,病死率居恶性肿瘤第三位[1]。诊断原发性肝癌目前已经确认的一些血清蛋白质标志物的敏感度和特异度有限,如一些肝脏良性疾病、生殖腺胚胎源性肿瘤和转移性肝癌等也表现出甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)升高,部分肝癌患者AFP浓度始终保持低水平状态[2]。有研究[3-4]表明在癌症患者外周血的循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)中可以找到由各种类型癌症引起的DNA碎裂产物,是一种可以通过检查人体血浆中的cfDNA来鉴别正常人还是潜在危险人群的方法。肿瘤相关基因发生甲基化修饰是导致肿瘤发生的早期事件[5],GNB4即鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β4亚基,是异源三聚体G蛋白的关键亚基,在许多种类的恶性肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用,如尿路上皮癌、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、胃癌等[6-9],研究[10]报道证实该基因的甲基化与肝癌的发生高度相关。Riplet是一个泛素连接酶,研究[11]表明Riplet促进维甲酸诱导基因Ⅰ介导的干扰素β启动子激活,抑制负链RNA病毒的增殖,该基因的甲基化作为诊断肝细胞癌的分子标志物也有相关报道[12-13]。该研究通过对人外周血血浆cfDNA中GNB4和Riplet基因甲基化以及血清AFP的检测,探讨AFP、GNB4和Riplet基因甲基化单独和联合检测在原发性肝癌诊断中的诊断效能和临床价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2022年12月至2023年8月在安徽医科大学第一附属医院就诊的313例患者作为研究对象。78例原发性肝癌患者,其中男性62例,女性16例,年龄19～84(61.47±12.24)岁。157例良性肝脏疾病患者,其中男性89例,女性68例,年龄20～78(43.96±12.21)岁,包含肝硬化30例,乙型肝炎87例,丙型肝炎4例,自身免疫性肝炎2例,胆汁淤积性肝炎1例,脂肪肝7例,其他良性肝病(肝血管瘤、肝囊肿等)26例。41例其他消化系统肿瘤患者,其中男性27例,女性14例,年龄37～86(66.10±10.83)岁,包含胃部恶性肿瘤19例,结直肠恶性肿瘤14例,胰腺恶性肿瘤4例,胆管恶性肿瘤4例。17例非消化系统肿瘤患者,其中男性13例,女性4例,年龄42～82(67.53±12.10)岁,包含肾恶性肿瘤8例,前列腺恶性肿瘤8例,尿路上皮癌1例。20例原发性肝癌术后患者。采用甲基化荧光定量PCR(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)法检测所有患者血浆中GNB4和Riplet基因甲基化水平,直接化学发光法(双抗体夹心法)检测血清AFP水平。本项研究已通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的审核与授权(YJ2022-09-06),所有参与者均签署了知情同意书。

1.1.1入选标准 ① 符合《原发性肝癌诊疗指南(2022年版)》[14]临床诊断标准的原发性肝癌患者。② 干扰患者：良性肝脏疾病患者,包括肝硬化、肝炎、脂肪肝、肝腺瘤、肝囊肿等;未经治疗的其他消化系统肿瘤患者,包括食管癌、胰腺癌、结直肠癌、胆囊/管癌、胃癌等;未经治疗的非消化系统肿瘤患者,包括肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、宫颈癌等。③ 行肝切除、移植的肝癌术后患者且有术前评价试剂检测。

1.1.2排除标准 ① 无术前评价试剂检测的肝癌术后患者和已接受放/化疗等治疗患者;② 肝癌合并患有其他恶性肿瘤;③ 未按要求保存或溶血的样本;④ 术前术后对照研究有远处转移的肝癌术后患者。

1.2 方法

1.2.1样本的采集、制备和保存 用含EDTA抗凝剂的采血管采集不少于10 ml的全血,颠倒8～10次混匀后立刻分离成血浆。不应放置在室温超过3 h或在2～8 ℃超过8 h,不可冷冻全血。以离心力 3 500 r/min离心10 min后提取血浆,放入15 ml的离心管内再次离心10 min(3 500 r/min),将血浆转入新的15 ml离心管内。血浆样本可被储存在2～8 ℃最多18 h,在-25～-15 ℃可稳定28 d,在(-80±5) ℃可储存12个月。选择无抗凝剂的干燥管采集2～3 ml全血,离心5 min(转速3 500 r/min)获取血清检测AFP。室温可储存8 h,2～8 ℃可保存48 h,若48 h不能完成检测则将标本冷冻于-20℃。

1.2.2样本的处理 ① 核酸提取：取2 ml血浆,使用核酸提取试剂进行核酸提取,获取cfDNA。② 亚硫酸氢盐转化及纯化：取获得的核酸提取液35 μl,使用核酸纯化试剂进行快速亚硫酸氢盐转化,并将转化液进行纯化。获得的纯化液即可用于GNB4和Riplet基因甲基化检测。③ PCR扩增：根据需扩增的样本数量配置PCR反应液并按10 μl/管分装至反应管中/板中,然后依次加入处理好的阴性对照、样本核酸转化液和阳性对照各40 μl。加样并盖好管盖或封膜,短暂离心30 s(2500 r/min)后,立即进行PCR扩增反应。

1.2.3实验结果的读取 利用ABI 7500实时荧光定量PCR分析仪获取数据。通过Atellica IM全自动化学发光免疫分析仪对血清中的AFP进行精确测量。

1.3 诊断标准本实验使用GNB4和Riplet基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法),由武汉艾米森生命科技有限公司提供。该试剂盒能够在体外对人的外周血血浆cfDNA中的GNB4和Riplet基因进行甲基化定性分析。根据说明书,待测样本内控基因ACTB Ct值≤35(VIC通道)则样本有效,否则判定样本无效。阴性对照应符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值>43或Unde(无扩增);阳性对照应符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值≤33。阴阳性对照和内控合格后,对检测结果进行判定：Ct值≤43(FAM通道),且呈S型扩增曲线趋势,GNB4甲基化阳性;Ct值≤43(ROX通道),且呈S型扩增曲线,Riplet甲基化阳性;Ct值>43或Unde(无扩增)为阴性。联合检测采用平行联合诊断法,当有一个检测结果判定为阳性则诊断为阳性。

根据目前国际上普遍接受的临界值20 ng/ml,AFP<20 ng/ml为AFP阴性组,而20≤AFP<200 ng/ml为AFP低水平组,若AFP≥200 ng/ml为AFP高水平组。

1.4 统计学处理使用SPASS 22.0软件进行数据处理。采用χ2检验,方差检验,二元logistics回归分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各分组基因甲基化检测结果不同分组基因甲基化的检测结果见表1,GNB4和Riplet基因的甲基化阳性率在原发性肝癌组中显著超过了其他各个分组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 GNB4和Riplet在不同分组阳性率的比较

2.2 各分组年龄、性别、AFP结果的分布情况肿瘤组患者的平均年龄高于肝良性疾病组,且男性患者比例也高于肝良性疾病组,差异均有统计学意义(P<0.05)。78例肝癌患者中AFP<20 ng/ml有33例(42.31%),而在157例肝良性疾病中AFP≥200 ng/ml有3例(1.91%),在17例非消化系统肿瘤患者中AFP≥200 ng/ml有1例(5.88%),各组具体分布情况见表2。

2.3GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP浓度中的表达情况78例原发性肝癌患者GNB4和Riplet基因甲基化的表达水平在不同血清AFP浓度的情况,见表3。GNB4和Riplet基因甲基化联合检测时在3个分组中差异无统计学意义(P=0.103>0.05)。

表3 GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同 AFP 浓度分组中表达情况

2.4 AFP、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化单独和联合检测在原发性肝癌中的诊断效能评价

表4 各指标诊断肝癌多因素回归分析结果

2.4.2构建原发性肝癌的诊断模型并绘制ROC曲线 根据GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、性别、年龄及血清AFP这些指标创建6个诊断模型,见表5,且绘制ROC曲线,见图1。其中 AFP 诊断模型曲线下面积AUC为0.775(95%CI0.706～0.844),灵敏度为51.3%,特异度为94.3%。GNB4基因甲基化诊断模型ROC曲线下面积AUC为 0.912(95%CI0.862～0.962),灵敏度为83.3%,特异度为99.4%。Riplet基因甲基化诊断模型曲线下面积AUC为0.860(95%CI0.799～0.921),灵敏度为73.1%,特异度为99.4%。GNB4和Riplet基因甲基化联合诊断模型曲线下面积AUC为0.958(95%CI0.923～0.998),灵敏度为92.3%,特异度为98.7%。AFP、GNB4和Riplet基因甲基化三者联合诊断模型曲线下面积AUC为0.956(95%CI0.917～0.994),灵敏度为92.3%,特异度为98.7%,当加入年龄与性别这两个因素后的联合诊断模型 AUC为0.989(95%CI0.979～1.000),灵敏度为93.6%,特异度为97.5%。各模型曲线下面积结果差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 不同诊断模式ROC曲线分析

表5 不同诊断模式对原发性肝癌的诊断效能评价

3 讨论

GNB4基因编码异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)的β亚基,其在信号转导中起着至关重要的作用[9],Riplet基因又称RNF135基因,作为E3泛素连接酶的作用,通过调节T细胞中的Th1和CTLs来抑制抗肿瘤免疫反应[11],两者甲基化均可导致肿瘤的发生。本研究中原发性肝癌GNB4基因甲基化阳性率为82.05%,明显高于肝良性疾病组的0.63%、其他消化系统肿瘤组的31.71%、其余组别的0%,同时肝癌组Riplet基因甲基化阳性率为71.79%,明显高于其他消化系统肿瘤组的2.44%和其他分组的0%,显示相比于肝良性疾病和其他肿瘤患者,肝癌患者外周血液中有GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化的存在且水平明显较高,与相关研究[15]相符,将GNB4和Riplet基因甲基化联合检测,在原发性肝癌组的阳性率达到92.31%,高于GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化单独检测,提高了对肝癌患者的诊断效能。

血清AFP是诊断肝癌与疗效监测常用且重要的肿瘤标志物,但其敏感度较低,在部分肝癌中呈现低水平,尤其在肿瘤直径小于2 cm的早期微小肝癌患者中。分析本研究中各分组AFP水平,在原发性肝癌组中AFP<20 ng/ml占42.31%,20≤AFP<200 ng/ml占25.64%,而在肝良性疾病中20≤AFP<200 ng/ml有10.19%,AFP≥200 ng/ml有1.91%,显示在原发性肝癌中仍有相当一部分患者血清AFP呈现低水平,甚至阴性,一些良性肝病、其他恶性肿瘤中也表现出 AFP 升高,AFP灵敏度和特异度存在局限性,与相关研究[2]基本一致。当前研究将其它不同的肿瘤指标与AFP联合检测以提高诊断的敏感度。

为进一步探讨GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化在肝癌诊断中的应用,将78例原发性肝癌患者作为实验组,157例肝良性疾病患者作为对照组,以进行更深层次的分析。对两组年龄和性别进行比较,肝癌患者的平均年龄大于肝良性疾病患者,肝癌患者男性占比高于肝良性疾病患者,与文献[2]报道一致,这可能与男性性激素和x相关的遗传因素有关[2]。通过多因素回归分析,年龄、性别、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化均与肝癌的发生显著相关。关于GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP浓度中的表达情况的分析显示：GNB4和Riplet基因甲基化联合检测在不同AFP浓度中的表达结果差异无统计学意义(P=0.103),显示在AFP低水平和AFP阴性的肝癌患者中仍有较好的诊断效能,同时该结果也证实了无论血清AFP的表达情况如何,都可以采用GNB4和Riplet基因甲基化联合检测对原发性肝癌进行筛查,这为肝癌的诊断提供了更多的参考指标。最后,本研究将GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、年龄、性别以及血清AFP指标建立6个诊断模型绘制了ROC曲线。结果显示,对于原发性肝癌的诊断,GNB4和Riplet基因甲基化联合检测诊断的灵敏度显著高于单独AFP,也高于GNB4和Riplet基因甲基化单独诊断的灵敏度;同时,GNB4基因甲基化诊断的灵敏度较Riplet基因甲基化高。联合年龄、性别、AFP、GNB4和Riplet基因甲基化的诊断灵敏度最高,达到93.6%。各检测指标及组合诊断模型中,AFP的特异度94.3%相对稍低一点,其余特异度均较高,且基本无差异。

本研究因时间有限,纳入研究的原发性肝癌患者数量不够多,其他纳入研究的恶性肿瘤种类及患者数量均有限,存在一定局限,后续可扩大样本量进一步验证。对于原发性肝癌术后患者,本研究在手术3 d后采集患者血液,未能做到术后连续监测AFP、GNB4和Riplet基因甲基化水平的变化,且因样本量较少未做更多研究和探讨,后续可进一步做补充实验。