IL-35下调CD36表达减少巨噬细胞内脂质积累缓解动脉粥样硬化的机制研究*

李晟，茅光耀，葛若木，李凯园，朱莉

（1.大连医科大学 研究生院，辽宁 大连 116044；2.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）是一种由脂质引起的慢性炎症、纤维增生性疾病[1]。动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是CHD的发病基础，主要特征是血管内脂质的异常积聚和炎症反应的形成[2-3]。研究表明，人类白细胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）、A类清道夫受体（scavenger receptor class A，SR-A）和凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（low-density lipoprotein receptor-1，Lox-1）等清道夫受体介导巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）功能异常，会导致泡沫细胞异常积聚，与AS病变密切相关[4-6]。

白细胞介素-35（Interleukin-35，IL-35）是由CD4+Foxp3+调节性T细胞分泌的异二聚体细胞因子，由EB病毒诱导基因3和p35 2个亚单位组成[7-8]。IL-35具有抗AS活性，CHD患者血清IL-35水平显著下降，并与Gensini积分和冠状动脉病变血管数呈负相关[9-11]。外源性IL-35可增加ApoE-/-小鼠Treg细胞水平，缩小AS斑块尺寸[12]。然而，IL-35对CD36、SR-A和Lox-1等清道夫受体表达的影响，以及脂质代谢的调节作用机制仍需进一步研究。本研究旨在分析CHD患者血清IL-35水平与血脂四项的相关性，分析IL-35对人髓系白血病单核细胞（human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1）源性巨噬细胞脂代谢的影响及对p38 MAPK信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2022年6月—2023年6月在泰州人民医院心内科就诊的疑似CHD患者。随机选取154例，根据冠状动脉造影结果分为CHD组（86例）和对照组（68例），收集性别、年龄、身高、吸烟史、血压、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB），总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、血糖（Glucose，GLU）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等指标。排除标准：①存在心肌病和瓣膜性心脏病；②患有急性或慢性传染病和自身免疫性疾病；③甲状腺功能亢进或减退；④肝肾功能不全，消化、血液系统疾病；⑤使用汀类药物治疗＞ 1周；⑥近期有手术或外伤史；⑦病历资料不完整。本研究经医院医学伦理委员会批准（批准号：KY202311401），所有研究对象签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

THP-1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），特异性抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司），胆固醇检测试剂盒、油红染色试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司），NBD-胆固醇、IL-35、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）（美国R＆D公司），IL-35酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。荧光PCR仪（美国罗氏公司），酶标仪（美国BioTek公司）、荧光显微镜（德国徕卡公司）。

1.3 血液标本采集及IL-35测定

使用EDTA 2K抗凝管采集所有研究对象空腹状态静脉血，1 200 r/min离心10 min，吸取上清液于-80℃冰箱备用。按照试剂盒说明书进行操作测定IL-35水平。设置空白孔、标准品孔和样品孔，在450 nm波长处测定各孔的光密度（optical density，OD），用标准品浓度与OD值拟合直线方程，再将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度。

1.4 THP-1细胞制备及IL-35最适浓度的确定

THP-1细胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI 1640培养基中培养1周（37 ℃、5%二氧化碳CO2），100 nmol/L PMA处理THP-1细胞48 h，使其分化为巨噬细胞。取巨噬细胞分为4组：①对照组：5 μmol/L DMSO培养细胞7 d；②oxLDL组：5 μmol/L DMSO培养细胞7 d后，50 μg/mL oxLDL继续培养48 h；③低剂量组：20 ng/mL IL-35培养7 d后，50 μg/mL oxLDL继续培养48 h；④高剂量组：40 ng/mL IL-35培养7 d后，50 μg/mL oxLDL继续培养48 h。

按照试剂盒说明书步骤对各组细胞进行油红染色，测定各组细胞内TC、游离胆固醇（free cholesterol，FC）和胆固醇酯（cholesteryl ester，CE）水平。根据染色和测定结果确定IL-35最适实验浓度。

1.5 NBD-胆固醇评估细胞内胆固醇的摄取

实验组用IL-35进行预处理，以未加药组为对照组，于培养箱培养7 d，加入5 μmol/L NBD-胆固醇后2、4、6、8和10 h在免疫荧光显微镜下进行拍摄，荧光显微镜下观察细胞内NBD-胆固醇呈深绿色。使用RIPA裂解细胞并收集裂解液，在469和537 nm波长处测定荧光强度（fluorescence intensity，FI）定量评估两组NBD-胆固醇的摄取情况。

1.6 Western blotting检测CD36、SR-A、Lox-1、p38、p-p38蛋白的表达

IL-35组用IL-35预处理7 d；以未加药组为对照组；实验组用IL-35预处理7 d后加入50 μg/mL oxLDL共培养48 h；oxLDL组用5 μmol/L DMSO培养THP-1细胞7 d后，50 μg/mL oxLDL继续培养48 h；P79350组加入P79350预处理24 h后按实验组步骤处理。提取细胞蛋白，加入Loading Buffer，95 ℃金属浴变性5 min。采用SDS-PAGE电泳将蛋白分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶密封2 h。4 ℃条件下一抗孵育过夜后与二抗在室温下孵育2 h，用化学发光法检测目的蛋白。使用Image J软件分析蛋白相对表达量。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应检测CD36、SRA和Lox-1 mRNA的表达

细胞分组同1.6。提取THP-1细胞总RNA，取500 ng逆转录为cDNA，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）反应体系：2 μL cDNA，正反向引物各1 μL（10 μm），SYBR green 10 μL，H2O 6 μL；反应条件：95 ℃预变性3 s，95 °C变性30 s，60 ℃退火1 min，共计40个循环，记录Ct值。采用2-ΔΔCT法计算CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相对表达量。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与CHD组临床资料比较

对照组与CHD组的年龄、吸烟史、体质量指数（body mass index，BMI）、TG、HDL-C、CK、CK-MB、CRP水平比较，经χ2或t检验，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CHD组年龄、TG、CK、CK-MB、CRP水平均高于对照（P＜0.05），而HDL-C水平和BMI均低于对照组（P＜0.05）。对照组与CHD组的性别构成、高血压、高脂血症、SBP、DBP、GLU、TC、LDL-C、LVEF比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 对照组与CHD组临床资料比较

2.2 CHD组与对照组血清IL-35水平比较及与血脂四项的相关性

CHD组、对照组血清IL-35水平分别为（42.76±13.79）、（109.45±28.87）pg/mL，经t检验，差异有统计学意义（t=-17.805，P=0.000）；CHD组血清IL-35水平低于对照组。

Spearman相关性分析结果表明，CHD患者血清IL-35水平与TC、LDL-C、TG均呈负相关（rs=-0.321、-0.218和-0.215，P=0.003、0.044和0.047），与HDL-C呈正相关（rs=0.322，P=0.003）。

2.3 各组油红染色结果和细胞内胆固醇水平比较

油红染色结果显示对照组THP-1细胞内无红染，oxLDL组细胞内脂滴增多，红染加重。低剂量组与oxLDL组比较，细胞内红染面积无显著变化。高剂量组与oxLDL组和低剂量组比较，细胞内脂滴明显减少，红染减轻。见图1。

图1 各组THP-1细胞油红染色 （×200）

对照组、oxLDL组、低剂量组、高剂量组THP-1细胞内TC、FC、CE水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，oxLDL组TC、FC、CE均升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组TC、FC、CE均降低（P＜0.05）。40 ng/mL IL-35能有效减少泡沫细胞的形成和脂质的积聚，故将此浓度作为后续实验使用浓度。见表3。

表3 各组THP-1细胞内TC、FC、CE水平比较（μmol/mgrot，±s）

表3 各组THP-1细胞内TC、FC、CE水平比较（μmol/mgrot，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与oxLDL组比较，P＜0.05；③与低剂量组比较，P＜0.05。

CE 3.92±0.26 27.10±2.64①24.00±2.26①9.03±0.7①②③161.000 0.000组别对照组oxLDL组低剂量组高剂量组F 值P 值TC 5.42±0.16 35.94±2.5①32.00±3.08①13.71±0.61①②③158.100 0.000 FC 1.50±0.16 8.84±0.16①8.00±1.03①4.68±1.29①②③13.670 0.002

2.4 对照组与实验组THP-1细胞对NBD-胆固醇的摄取

实验组与对照组THP-1细胞内NBD-胆固醇随着时间增加逐渐增加。在各时间点，实验组与对照组比较，细胞内NBD-胆固醇含量均明显减少。见图2。

图2 对照组与实验组THP-1细胞对NBD-胆固醇的摄取 （×200）

对照组与实验组THP-1细胞2、4、6、8和10 h的FI比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点FI比较，差异有统计学意义（F=726.726，P=0.000）；②实验组与对照组FI比较，差异有统计学意义（F=8.102，P=0.012），实验组FI较低；③两组FI变化趋势比较，差异有统计学意义（F=111.061，P=0.000）。见表4。

表4 对照组与实验组THP-1细胞不同时间点FI比较 （±s）

表4 对照组与实验组THP-1细胞不同时间点FI比较 （±s）

组别对照组实验组2 h 1 536.7±143.3 967.7±83.0 4 h 3 207.0±149.3 2 035.0±88.3 6 h 4 665.0±127.9 3 421.3±100.1 8 h 5 048.3±310.2 3 791.0±182.7 10 h 5 092.7±152.9 3 863.3±232.7

2.5 各组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相对表达量比较

对照组、IL-35组、oxLDL组、实验组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）；oxLDL组和实验组CD36、SR-A、Lox-1蛋白相对表达量均高于对照组和IL-35组（P＜0.05），实验组CD36蛋白相对表达量低于oxLDL组（P＜0.05）。见表5和图3。

图3 各组THP-1细胞CD36、SR-A、Lox-1蛋白的表达量

表5 各组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相对表达量比较 （±s）

表5 各组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与IL-35组比较，P＜0.05；③与oxLDL组比较，P＜0.05。

Lox-1蛋白0.65±0.01 0.76±0.12 1.17±0.19①②1.01±0.09①②11.270 0.003组别对照组IL-35组oxLDL组实验组F 值P 值CD36蛋白0.63±0.09 0.40±0.02①1.29±0.14①②1.08±0.09①②③113.800 0.000 SR-A蛋白0.40±0.02 0.50±0.03 1.18±0.13①②0.99±0.11①②56.840 0.000

2.6 各组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相对表达量比较

对照组、IL-35组、oxLDL组、实验组THP-1细胞CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）；oxLDL组和实验组CD36、SR-A Lox-1 mRNA相对表达量均高于对照组和IL-35组（P＜0.05），实验组CD36 mRNA相对表达量低于oxLDL组（P＜0.05）。见表6。

表6 各组THP-1细胞CD36、SR-A、Lox-1 mRNA相对表达量比较 （±s）

表6 各组THP-1细胞CD36、SR-A、Lox-1 mRNA相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与IL-35组比较，P＜0.05；③与oxLDL组比较，P＜0.05。

Lox-1 mRNA 1.00±0.05 0.93±0.05 3.27±0.21①②3.19±0.28①②159.800 0.000组别对照组IL-35组OxLDL组实验组F 值P 值CD36 mRNA 1.00±0.04 0.81±0.07①1.88±0.09①②1.50±0.05①②③161.200 0.000 SR-A mRNA 1.04±0.39 0.89±0.35 3.02±0.65①②2.66±0.35①②17.270 0.000

2.7 各组THP-1细胞p-p38/p38蛋白相对表达量比较

对照组、IL-35组、oxLDL组、实验组THP-1细胞p-p38/p38蛋白相对表达量分别为（0.23±0.06）、（0.23±0.07）、（1.48±0.2）、（0.91±0.11），经方差分析，差异有统计学意义（F=74.000，P=0.000）；oxLDL组和实验组p-p38/p38蛋白相对表达量均高于对照组和IL-35组（P＜0.05），实验组p-p38/p38蛋白相对表达量低于oxLDL组（P＜0.05）。见图4。

图4 各THP-1细胞p-p38/p38蛋白的表达

2.8 各组THP-1细胞CD36蛋白相对表达量比较

对照组、oxLDL组、实验组、P79350组THP-1细胞CD36蛋白相对表达量分别为（0.63±0.09）、（1.29±0.14）、（1.08±0.00）、（1.17±0.11），经方差分析，差异有统计学意义（F=35.090，P=0.000）；oxLDL组、实验组、P79350组CD36蛋白相对表达量均高于对照组（P＜0.05），oxLDL组和P79350组CD36蛋白相对表达量均高于实验组（P＜0.05）。见图5。

图5 各组THP-1细胞CD36蛋白的表达

3 讨论

AS是CHD患者最基本的病理变化，主要特点是动脉壁脂质的积累和炎症的发展。AS病变发展的早期阶段被称为“脂肪条纹”，其特征是泡沫细胞在细胞内积聚脂质[13-14]，研究表明，白细胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）家族因子与急性心肌梗死、主动脉夹层、心肌肥厚等多种心血管疾病密切相关[15-17]，在AS的发生、发展过程和泡沫细胞的形成中发挥重要作用[18]，IL-35为IL-12家族一员，可作为抗炎因子参与自身免疫性炎症疾病，如狼疮性肾炎、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的发生、发展[19-21]。最近研究显示，IL-35高表达可以延缓动脉粥样硬化的发展，调节脂代谢相关蛋白基因或非编码RNA的表达[22-24]。本研究首先通过分析CHD患者血清IL-35水平与血脂四项的相关性，发现CHD患者血清IL-35水平与HDL-C呈正相关，与TC、TG，LDL-C均呈负相关。

本研究通过油红染色和THP-1内胆固醇检测明确IL-35对泡沫细胞的形成有抑制作用，同时发现40 ng/mL IL-35能有效抑制THP-1细胞内脂质积聚，故将40 ng/mL作为本实验的使用浓度。脂质的摄取是泡沫细胞形成的重要环节，THP-1细胞对脂质的摄取主要由清道夫受体CD36、SR-A和Lox-1介导。本研究通过NBD-胆固醇摄取实验来测定不同时间点实验组与对照组细胞FI，结果显示在相同时间点，实验组细胞FI明显低于对照组。Western blotting和qRT-PCR检测与脂质摄取相关的清道夫受体（CD36、SR-A和Lox-1）蛋白和mRNA的表达发现，IL-35显著降低了oxLDL诱导的CD36蛋白和mRNA表达，而SR-A和Lox-1的表达无显著变化，提示IL-35可能是通过下调清道夫受体CD36的表达来抑制THP-1细胞对脂质的摄取。

p38 MAPK信号传导在多种生物过程中起重要作用，例如炎症、细胞周期调节、细胞死亡、发育、分化和衰老[25-27]。既往研究表明p38 MAPK通路与AS、心脏重构、心肌肥大和纤维化密切相关，是心血管疾病的治疗靶点[28-30]。本研究发现oxLDL处理THP-1细胞48 h后，细胞p38总蛋白无显著变化，而p-p38/p38表达上调，而经IL-35预处理7 d后p-p38/p38表达下调，提示p38磷酸化水平被IL-35抑制。添加P79350作为p38 MPAK通路激动剂进行预处理后，P79350逆转了IL-35对oxLDL诱导的细胞所表现出的作用，CD36的表达显著升高。因此，推测IL-35可能使p38 MAPK信号通路失活，降低p38的磷酸化水平，从而抑制清道夫受体CD36的表达，最终抑制THP-1细胞对脂质的摄取和泡沫细胞的形成。

综上所述，本研究验证了CHD患者血清IL-35水平与血脂四项有相关性。体外实验验证IL-35通过下调清道夫受体CD36的表达从而减少THP-1细胞对脂质的积聚和泡沫细胞的形成，可能与IL-35下调p38 MAPK信号通路有关。本课题组仅在细胞水平验证IL-35对THP-1细胞的影响，IL-35在动物模型上是否存在相同的机制，仍需进一步探索。