牛膝盐炙工艺研究

张世豪，那叶馨，东娇娇，胡建华，薛金浩，高诗雯，杨柳

（黑龙江中医药大学，北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）为苋科植物牛膝（AchyranthesbidentataBl.）的干燥根，味苦、甘、酸，性平，归肝、肾经，具有填精补髓、益阴活血的功效，是传统滋补肝肾、强健筋骨的中药。临床主要用于治疗腰膝骨痛、四肢拘挛、筋骨无力以及痿痹等症［1-2］。研究表明，牛膝具有多种药理作用，包括免疫系统调节、抗生育、抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗衰老、抗骨质疏松和对心血管和神经系统作用等［3-7］。

炮制可以改变药性，提升疗效，降低毒性。根据古籍记载，牛膝生用可散瘀血、消肿痛、引血下行，盐炙后能引药入肾，增强其补肝肾、强筋骨的作用。牛膝经不同炮制工艺炮制后，化学成分发生较大的变化，导致药理作用改变。现代牛膝常用的炮制方法为盐炙、酒炙、炒炭等，如炮制后酒牛膝可增强活血通络作用；盐牛膝能引药下行入肾，发挥补肾养精作用；牛膝炭主要发挥止血之功。2020 版《中华人民共和国药典》中对于盐炙药材的描述均是加入定量食盐（药材100 g，盐2 g），文火加热，炒干。但牛膝盐炙工艺的参数还不完善，加盐量没有针对性，炒制温度和时间也不统一，使盐炙品的内在质量难以得到有效控制，影响其临床用药的准确性，很难将药理实验结果和其物质含量差异进行联系，也不能为解读药效学差异提供帮助。

道地药材质量与炮制方法密切相关，牛膝作为我国临床常用的大宗药材之一，建立统一的、质量可控的、数字化炮制标准势在必行。因此，以课题组前期确定的牛膝补肾壮骨的有效成分——β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷R0及竹节参皂苷Ⅳa为评价指标［8-9］，选取加盐量、炒制温度和炒制时间为考察因素，用单因素和Box-Behnken 设计方法优化牛膝的盐炙工艺。以期能够得到最佳的炮制工艺，保证牛膝的临床疗效，并为牛膝的规范化盐炙提供参考依据。

1 材料与仪器

标准品：β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa（批号：5289-74-7、34367-04-9、51415-02-2，天津西玛科技有限公司）；甘草素（IS）（批号：578-86-9，中国成都亚德生物科技有限公司）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮（由本实验室从牛膝中分离纯化，并经NMR 和MS 谱等数据鉴定化学结构，标准品纯度均 ≥ 98%）；牛膝药材（河南省，经检验符合《中华人民共和国药典》相关规定）。

超高效液相串联质谱分析仪（美国Thermo 公司）；超声波清洗器（KQ-5000DB，昆山市超声仪器有限公司）；送风定温干燥箱（WFO-410W，上海爱朗仪器有限公司）；旋转蒸发仪（EYEL4 OSB-2100，东京爱朗仪器有限公司）；高速粉碎机（800AD，永康市艾泽拉电器有限公司）；分析天平（NewClassicMF，Mettler Toledo Switzertand 公司）；电热恒温水浴锅（HSS，上海博讯事业有限公司医疗设备厂）。乙腈（Thermo Fisher Scientific）、乙酸（Dikma）均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；柱温：40 ℃。流动相：乙腈（A%）和0.3%乙酸水（V/V，B%）。梯度洗脱条件见表1，总离子流图见图1。

表1 梯度洗脱条件

图1 总离子流图

2.1.2 质谱条件的选择

配备有电喷雾离子源的三重四级杆质谱仪，在SRM 模式下进行负离子扫描。喷射电压：-3 000 V；鞘气：30 Arb；辅助气：10 Arb；离子传输管温度：325 ℃；蒸发器温度：350 ℃；辅助器：2 L/min；全程通入氮气。5 种有效成分及内标化合物的检测离子对及其质谱参数见表2；5 种有效成分的代表质谱图见图2。

表2 5种有效成分及内标的质谱条件

图2 有效成分的代表质谱图

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取5种有效成分适量，配置成混合对照品溶液。各成分的浓度分别为：β-蜕皮甾酮0.989 0 mg/mL、25R-牛膝甾酮0.981 0 mg/mL、25S-牛膝甾酮1.102 0 mg/mL、人参皂苷R00.997 0 mg/mL 以及竹节参皂苷Ⅳa 0.976 0 mg/mL。

2.1.4 供试品溶液的制备牛膝样品均粉碎并筛分（60目）。取0.5 g样品于烧瓶中，浸泡于50 mL 50%的甲醇溶剂中，然后在40 ℃水浴中超声60 min，得供试品溶液，4 ℃保存待测。

2.1.5 标准曲线

以进样浓度为横坐标（x），以对照品和内标峰面积比为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程。相关系数（R2）均大于0.999 3，这表明5 种有效成分均在其线性范围内呈现了良好的线性关系。5 种有效成分的回归方程、相关系数及线性范围结果见表3。

表3 5种有效成分的回归方程、相关系数及线性范围

2.1.6 系统适应性

精密度测试，精密吸取上述供试品溶液适量，24 h内连续测6 次，连续测定3 d，计算相对标准差（relative standard deviation，RSD）。结果表明各有效成分的精密度RSD ＜ 1.32%，表明该方法精密度良好。

重复性测试，精密称取同一批样品，记录5 种有效成分的色谱峰面积，并计算峰面积的RSD 值，考察方法的重现性。结果表明各有效成分的重复性RSD ＜2.60%，表明该方法重复性良好。

稳定性测试，取同一批次的供试品溶液适量，分别于0、4、8、16、32、48 h进样分析，记录峰面积，考察供试品溶液在48 h内的稳定性。结果表明各有效成分的稳定性RSD ＜ 2.56%，表明该样品48 h内在4 ℃下稳定。

利用加样回收率试验对该方法的准确性进行评价，样品中加入了已知的低、中、高3 个浓度的标准溶液，每个浓度测定3 份。日内、日间精度、稳定性、重复性和准确性的结果见表4。该方法测定结果准确可靠。

表4 5种有效成分的精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验结果

回收率（%）=（测定平均值-样品值）/加入量×100%

2.2 盐炙工艺的单因素实验

2.2.1 炒制时间的单因素考察

牛膝原药材切制成7～8 mm 小段，精密称取6 份，每份100 g，放于保鲜盒中，加入2 g 食盐配成的盐水焖润，炒制温度为100 ℃，炒制时间分别为10、15、20、25、30 min，牛膝炒后粉碎过筛（60 目），样品在甲醇浓度50%（V/V），料液比是1∶8（g/mL），提取时间为60 min，提取次数2 次的条件下分别进样分析。在炒制温度和加盐量一定的条件下，随着炒制时间的延长，5 种有效成分的总含量先升高后下降，过长的加热时间会导致有效成分遭到破坏致使有效成分的含量降低。当炒制时间为20 min时，有效成分的含量最高，因此确定最佳炒制时间为20 min。见图3。

图3 不同因素对盐炙效果的影响

2.2.2 炒制温度的单因素考察

2 g 食盐配成的盐水焖润，炒制时间为20 min，炒制温度分别为80、90、100、110、120 ℃，牛膝炒后粉碎过筛（60 目），样品在甲醇浓度50%（V/V），料液比为1∶8（g/mL），提取时间60 min，提取次数2 次的条件下分别进样分析。其中炒制温度为100 ℃结果最佳。炒制时间和加盐量一定的条件下，随着炒制温度的升高，5 种有效成分的总含量先升高后下降，过高的温度会导致有效成分遭到破坏致使有效成分的含量降低。当炒制温度为100 ℃时，有效成分含量最高，因此确定最佳炒制温度为100 ℃。见图3。

2.2.3 加盐量的单因素考察

加入1%、2%、3%、4%、5%的10 mL 盐水焖润，炒制时间为20 min，炒制温度100 ℃，甲醇浓度50%（V/V），料液比为1∶8（g/mL），提取时间60 min，提取次数2 次。在炒制时间和炒制温度一定的条件下，随着加盐量的升高，5 种有效成分的总含量先升高后下降，加盐量为2%时，有效成分的含量最高，因此确定最佳加盐量为2%。见图3。

2.3 盐炙工艺的响应面法

2.3.1 回归方程的建立及结果

采用基于Box-Behnken设计法优化牛膝盐炙工艺。在单因素试验基础上，盐炙考察因素设定为炒制温度，炒制时间，加盐量。根据响应面法设计，每个因素设3水平，分别以-1.00，0.00，1.00进行编码。代码值所代表的实际操作物理量见表5，试验安排及结果见表6。

表5 响应面法实验因素与水平

表6 盐炙工艺BBD实验设计

2.3.2 牛膝最佳盐炙工艺的优化结果

2.3.2.1 β-蜕皮甾酮

采用Design-Expert 软件对牛膝盐炙工艺的试验数据进行分析，得到β-蜕皮甾酮含量对加盐量、炒制时间、炒制温度的二次多元回归模型方程Y = 59.73 +7.74A - 3.21B + 0.54C - 1.26AB + 0.94AC - 0.12BC -19.49A2- 8.31B2- 0.38C2。方差分析结果见表7，模型决定系数R2= 0.957 6，表明该模型对实际值的模拟效果良好，试验误差小；表中F值和P值分别是17.57和0.000 5，表明β-蜕皮甾酮拟合模型显著。其中，在交互项中，AB 值最大，说明加盐量和炒制温度对β-蜕皮甾酮含量影响较大。

表7 β-蜕皮甾酮方差分析

2.3.2.2 25R-牛膝甾酮

采用Design-Expert 软件对牛膝盐炙工艺的试验数据进行分析，得到25R-牛膝甾酮含量对加盐量、炒制时间、炒制温度的二次多元回归模型方程Y = 2.09 +0.2A - 0.16B + 0.001 6C + 0.17AB - 0.038AC -0.006 3BC - 0.31A2- 0.12B2+ 0.096C2。方差分析结果见表8，模型决定系数R2= 0.916 8，表明该模型对实际值的模拟效果良好，试验误差小；表中F值和P值分别是8.57和0.004 9，表明25R-牛膝甾酮拟合模型显著。其中，在交互项中，AB值最大，说明加盐量和炒制温度对25R-牛膝甾酮含量影响较大。

2.3.2.3 25S-牛膝甾酮

采用Design-Expert 软件对牛膝盐炙工艺的试验数据进行分析，得到25S-牛膝甾酮含量对加盐量、炒制时间、炒制温度的二次多元回归模型方程Y = 3.06 +0.36A - 0.16B + 0.059C + 0.091AB - 0.16AC -0.33BC - 0.49A2- 0.74B2- 0.29C2。方差分析结果见表9，模型决定系数R2= 0.944 9，表明该模型对实际值的模拟效果良好，试验误差小；表中F值和P值分别是13.34 和0.001 3，表明25S-牛膝甾酮拟合模型显著。其中，在交互项中，BC 值最大，说明炒制温度和炒制时间对25S-牛膝甾酮含量影响较大。

表9 25S-牛膝甾酮方差分析

2.3.2.4 人参皂苷R0

采用Design-Expert软件对牛膝盐炙工艺的试验数据进行分析，得到人参皂苷R0含量对加盐量、炒制时间、炒制温度的二次多元回归模型方程Y = 6.55 + 0.21A +0.2B + 0.043C - 0.013AB + 0.23AC + 0.009 5BC -2.08A2- 1.62B2- 1.42C2。方差分析结果见表10，模型决定系数R2= 0.978 2，表明该模型对实际值的模拟效果良好，试验误差小；表中F值和P值分别是34.82 和＜ 0.000 1，表明人参皂苷R0拟合模型显著。其中，在交互项中，AC 值最大，说明加盐量和炒制时间对人参皂苷R0含量影响较大。

表10 人参皂苷R0方差分析

2.3.2.5 竹节参皂苷Ⅳa

采用Design-Expert 软件对牛膝盐炙工艺的试验数据进行分析，得到竹节参皂苷Ⅳa 含量对加盐量、炒制时间、炒制温度的二次多元回归模型方程Y = 12.66 +1.02A - 0.59B + 0.035C - 0.56AB - 0.11AC + 0.29BC -2.92A2- 1.62B2- 0.19C2。方差分析结果见表11，模型决定系数R2= 0.970 4，表明该模型对实际值的模拟效果良好，试验误差小；表中F值和P值分别是25.46和0.000 2，表明竹节参皂苷Ⅳa拟合模型显著。其中，在交互项中，AB 值最大，说明加盐量和炒制温度对竹节参皂苷Ⅳa含量影响较大。

表11 竹节参皂苷Ⅳa方差分析

2.3.3 响应面分析因素间的相互作用

加盐量和炒制时间的交互作用与五种有效成分含量的关系的三维曲面图见图4。随着加盐量和盐炙时间逐渐增大，5 种有效成分的含量也逐渐增大；当增大到一定水平时，5 种有效成分的含量却逐渐下降，说明加盐量和炒制时间两因素的交互作用明显。当加盐量较大时，5 种有效成分含量随着炒制温度的增大逐渐减小，见图5。当炒制时间一定时，5 种有效成分含量随着炒制温度的增大逐渐减小，见图6。综上所述，盐炙因素对有效成分的含量的影响由大到小依次为：加盐量 ＞ 炒制温度 ＞ 炒制时间。

图5 加盐量和炒制温度对有效活性成分的含量交互影响的三维曲面图和等高线图

图6 炒制时间和炒制温度对有效活性成分的含量交互影响的三维曲面图和等高线图

2.4 盐炙工艺的验证实验

结合Design-Expert，综合分析与实验可操作性等有关的各因素，分析认为最佳盐炙工艺为2%加盐量，炒制温度100 ℃，炒制时间20 min。采用上述最优盐炙工艺进行验证，重复实验3次，测得的主要成分的总含量较高，结果见表12。说明盐炙工艺的稳定可靠，重复性好，可操作性强，具有实际应用价值。

表12 盐灸工艺验证实验结果/（mg/g）

3 讨论

牛膝始载于《神农本草经》，具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效，用于腰膝酸痛、筋骨无力、经闭癥瘕、肝阳眩晕等。牛膝中含有皂苷类、甾酮类、多糖类、甜菜碱和多种微量元素等，其中以齐墩果酸型三萜皂苷、蜕皮甾酮和多糖类为其主要活性成分［10］。盐炙理论虽论述颇多，但仍以“入盐走肾”的理论为核心，临床上凡是归肾经的药物多进行盐炙［11］。历代中药盐炙方法有14 种，分别为盐水制、盐水润、盐水炙、盐水浸炒、盐水淹、盐水炒、盐水煮、盐水浸、盐水拌、盐水曝干、盐水煮、盐水拌炒、盐水蒸、盐水拌蒸［12］。现代炮制方法主要以盐炙、盐蒸等为主［13］。牛膝经盐炙后能够增强补肝肾、强筋骨之功效［14］，而药理研究证实牛膝中甾酮类物质（主要包括β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮等）有促进成骨细胞增殖作用［15］，牛膝中皂苷类物质（主要包括竹节参皂苷Ⅳa、人参皂苷R0等）有抑制破骨细胞以及保护损伤软骨细胞的作用［16-17］，这与盐牛膝补肝肾、强筋骨之效相吻合。因此本实验以课题组前期确定的牛膝补肾壮骨的5 种有效成分——β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮，人参皂苷R0及竹节参皂苷Ⅳa 为评价指标进行盐炙工艺研究。

在炮制工艺设计方面，相关的研究多是采用正交实验法和Box-Behnken响应面法［18-22］。正交实验同时考虑几种相关因素，寻找最佳因素水平组合，但是不能给出整个区域因素和响应值之间的一个明确函数表达式，从而无法找到最佳组合和响应值的最优值。而Box-Behnken 实验采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题［22］。因此，本研究采用Box-Behnken 响应面法对牛膝的盐炙工艺进行设计。

本实验采用超高效液相色谱串联质谱法，以β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷R0及竹节参皂苷Ⅳa 为评价指标，采用单因素及Box-Behnken 设计方法，优化牛膝的盐炙工艺。最终确定牛膝的最佳盐炙工艺为2%加盐量，炒制温度100 ℃，炒制时间20 min。本文建立的牛膝盐炙工艺稳定可靠，重复性好，可操作性强，具有较强的实际应用价值，有利于提高牛膝盐炙品的质量均一性，保证临床用药的有效性，为中药饮片的标准化和现代化提供依据。