双酶分步酶解盐津乌骨鸡肉工艺及其氨基酸组成分析

艾媛媛 刘菲菲 王晓华 王雪峰 肖智超 王桂瑛 范江平

摘要：以云南盐津乌骨鸡肉为原料，蛋白水解度为指标，采用响应面分析法优化盐津乌骨鸡肉酶解条件；用氨基酸分析仪及凝胶渗透色谱法检测酶解液的氨基酸组成和多肽分子量分布。结果表明，双酶分步酶解最佳工艺条件为动物蛋白酶酶解时间5 h、酶添加量2.6%、酶解pH值6.5，灭酶后，再加入木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解温度60 ℃。在该条件下，盐津乌骨鸡肉水解度为（32.62±0.79）%；酶解液中含有17种氨基酸，总游离氨基酸含量可达6.02 mg/mL，且亮氨酸、精氨酸等呈味氨基酸含量较高，其中多肽的相对分子质量主要集中分布在1 kDa以下。该研究结果可为后续盐津乌骨鸡相关新型调味制品的开发提供一定的理论依据。

关键词：盐津乌骨鸡肉；分步酶解；响应面优化；游离氨基酸；分子质量分布

中图分类号：TS201.25      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0028-08

Double-Enzyme Stepwise Enzymatic Hydrolysis Process of Yanjin Silky Fowl Chicken and Its Amino Acid Composition Analysis

Abstract： With Yunnan Yanjin silky fowl chicken as the raw material， protein hydrolysis degree as the index， the enzymatic hydrolysis conditions of Yanjin silky fowl chicken is optimized by response surface analysis method. The amino acid composition and molecular weight distribution of polypeptides of hydrolysates are detected by amino acid analyzer and gel permeation chromatography. The results show that the optimal process conditions for double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis are as follows： the enzymatic hydrolysis time of animal protease is 5 h， the addition amount of enzyme is 2.6%， the pH is 6.5， after enzyme inactivation， papain is added for  3 h enzymatic hydrolysis， the enzyme addition amount is 2.5%， and the enzymatic hydrolysis temperature is 60 ℃. Under such conditions， the hydrolysis degree of Yanjin silky fowl chicken is （32.62±0.79）%， there are 17 amino acids in the enzymatic hydrolysate， the content of total free amino acids could reach 6.02 mg/mL， the content of flavor amino acids such as leucine and arginine is higher， and the relative molecular weight of polypeptides is mainly concentrated below 1 kDa. The research results could provide some theoretical basis for the development of new seasoning products of Yanjin silky fowl chicken in the future.

Key words： Yanjin silky fowl chicken; stepwise enzymatic hydrolysis; response surface optimization; free amino acids; molecular weight distribution

云南獨特的地理气候环境孕育了许多种质特异的地方特色鸡资源，如无量山乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡、武定鸡、瓢鸡和盐津乌骨鸡[1]。其中，盐津乌骨鸡因产自云南省昭通市盐津县而得名，其肉质鲜嫩美味[2]、营养价值较高[3]，还具有保健药用功能[4]。随着食品工业的发展，鸡肉提供的优质蛋白在食品加工产业中被广泛应用[5]。研究表明，鸡肉经酶水解后的主要产物是多肽和游离氨基酸，不仅可以促进呈味物质的释放[6-7]，用于调味产品的开发，而且具有较高的营养价值和利用价值[8]。

蛋白酶酶解主要是蛋白酶作用于蛋白质的肽键，利用单一蛋白酶水解原料时，水解度低，风味物质释放不充分[9]；复合酶水解能够使不同的酶切位点互补，从而提升酶解液的水解度，还能降低酶解液的苦味，增加特征香味[10]，因此多采用复合酶水解制备呈味基料[11]。Li等[12]利用双酶酶解低值小龙虾后，暴露出更多的酶切位点，酶解产物的相对分子质量集中在0.5 kDa以下，主要以游离氨基酸和二肽形式存在。桂海佳等[13]利用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解制备牛肉酶解液，最佳工艺条件下水解度达（41.48±0.34）%。目前有关盐津乌骨鸡的研究主要集中在品质特性[14]和风味物质上[15]，对盐津乌骨鸡呈味肽的研究较少。本试验以云南盐津乌骨鸡肉为原料，利用双酶分步酶解鸡肉并进行工艺优化，然后测定酶解液中游离氨基酸和多肽的分子质量分布，以期为盐津乌骨鸡的高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

云南盐津乌骨鸡：购自云南本城农业科技有限公司，剔除鸡身所有油脂、皮、筋、腱、膜。

1.2 试剂

动物蛋白水解酶（5×104 U/g，食品级）：广东康达生物科技有限公司；风味蛋白酶（5×104 U/g，食品级）：河南万邦化工科技有限公司；中性蛋白酶（5×104 U/g，食品级）、木瓜蛋白酶（1×105 U/g，食品级）：南宁庞博生物工程有限公司；复合蛋白酶（1×105 U/g，食品级）：河南省万盛实业有限公司；甘氨酸：Biosharp生物科技公司；磷酸二氢钾：天津市风船化学试剂科技有限公司；D-果糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；磷酸氢二钠、茚三酮：广东光华科技股份有限公司。

1.3 主要仪器

PH828型pH计 东莞市希玛仪表有限公司；XMTD-7000型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；SPH120型消解仪 济南阿尔瓦仪器有限公司；Multiskan GO多功能酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；A300氨基酸分析仪 德国曼默博尔公司；PL-GPC220凝胶渗透色谱仪 美国Agilent公司。

1.4 试验方法

1.4.1 鸡肉酶解液的分步酶解工艺流程

原料预处理→加水混合→调节pH值→加第一种酶→水浴酶解→沸水浴灭酶10 min→调节pH值→加第二种酶→水浴酶解→沸水浴灭酶10 min→离心→取上清液→测水解度。

1.4.2 水解度的测定

参考肖雪等[16]的方法，采用茚三酮显色法测定鸡肉酶解液的游离氨基酸态氮含量。得到线性回归方程A=0.021 9C-0.000 6，R2=0.999 7。参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[17]对鸡肉中氮含量进行测定。按照下式计算水解度：

式中：c为甘氨酸浓度，μg/mL；n为稀释倍数；V为滤液体积，mL；N为氮含量，g/100 g；m為样品质量，g。

1.4.3 蛋白酶的筛选

以水解度为指标，固定料液比为1∶4、酶添加量为1.5%、酶解时间为4 h，在5种蛋白酶的最适pH值和最适温度下对鸡肉进行酶解，蛋白酶的种类及酶解条件见表1。对不同蛋白酶的酶解效果进行比较，选择水解度最高的两种蛋白酶进行双酶分步酶解试验。

1.4.4 单因素试验

按照1.4.3中的方法设定参考条件为料液比1∶4、动物蛋白酶添加量1.5%、酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 7.0；木瓜蛋白酶添加量1.5%、酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 6.0。分别考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解温度（45，50，55，60，65 ℃）、酶解时间（2，3，4，5，6 h）、酶解pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）对酶解鸡肉水解度的影响，确定各酶解条件的最适范围。

1.4.5 响应面优化试验

在动物蛋白酶、木瓜蛋白酶单因素试验的基础上，动物蛋白酶选取3个因素：酶添加量（A）、酶解时间（B）、pH值（C）；木瓜蛋白酶选取3个因素：酶添加量（A′）、酶解时间（B′）、酶解温度（C′）；以水解度作为响应值，分别进行三因素三水平试验设计。响应面设计因素水平见表2和表3。

1.4.6 鸡肉酶解液的游离氨基酸组成分析

取4 mL酶解液，加入1 mL 10%磺基水杨酸沉淀多肽及蛋白，置于2～8 ℃冰箱中冷藏静置60 min。用离心机以4 500 r/min离心15 min，用滤膜过滤后进样20 μL上机分析[18]，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法进行氨基酸测定[19]。

1.4.7 鸡肉酶解液的多肽分子量分布

鸡肉酶解液冻干后得到鸡肉多肽。采用凝胶渗透色谱法检测多肽相对分子质量分布。色谱柱：2×PLgel 8 μm aquagel-OH Mixed-M 7.5 mm×300 mm，流动相：水，示差折光检测器。标准品：PEG。

1.5 数据处理

每组试验重复3次，采用GraphPad Prism 8对试验数据进行绘图；采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验；采用IBM SPSS Statistics 25.0进行统计分析（P<0.05表示差异显著）；试验数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蛋白酶的筛选

由图1可知，在5种蛋白酶中，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最好，水解度分别为23.05%和9.78%。所以本试验选择动物蛋白酶、木瓜蛋白酶作为鸡肉酶解最佳用酶，且按照先动物蛋白酶后木瓜蛋白酶的顺序酶解。

2.1.2 酶添加量对水解度的影响

由图2可知，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的水解度整体呈先升高后降低的趋势；当酶添加量为2.5%时，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物的水解度分别为27.81%和27.70%，均达到最高值。造成这一现象的主要原因是：在反应前期，随着酶添加量的不断增加，酶与底物的结合率提高，此时水解速率与酶浓度的增加成正比；而当酶添加量高于2.5%时，底物逐渐被消耗而酶浓度过量，此时酶解反应达到饱和状态[20]，所以进一步提高酶用量不能直接提高水解度。因此，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量均为2.5%。

2.1.3 酶解pH值对水解度的影响

由图3可知，随着pH值的升高，动物蛋白酶水解液的水解度呈先升高后急剧降低的趋势。动物蛋白酶酶解产物的水解度在pH值为7.0时达到最大值，木瓜蛋白酶酶解产物的水解度在pH值为6.0时达到最大值。pH值的变化会对酶活性中心上必需基团的解离产生影响。pH值过高或过低都会影响酶的活性和稳定性。因此，蛋白酶随着pH值的变化有不同的反应状态，从而影响酶和底物之间的结合与催化。只有在最佳pH值下，才能使酶的活性达到最高[21]。因此，动物蛋白酶酶解盐津乌骨鸡肉的最佳pH值为7.0，木瓜蛋白酶的最佳pH值为6.0。

2.1.4 酶解温度对水解度的影响

由图4可知，随着温度的逐渐升高，动物蛋白酶在55 ℃时水解度达到最大，当温度大于55 ℃后水解度急剧下降后趋于平缓；木瓜蛋白酶在60 ℃时水解度达到最大。这是由于酶在酶解时存在一个最适温度，适当地升温有利于酶解速度的加快，而过高的温度则会导致酶失活，从而降低产物的水解度[22]。因此，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解盐津乌骨鸡肉的最佳酶解温度分别为55 ℃和60 ℃。

2.1.5 酶解时间对水解度的影响

由图5可知，随着酶解时间的增加，动物蛋白酶的水解度呈现先升高后降低又升高再降低的趋势，在酶解时间为5 h时水解度达到最大值。木瓜蛋白酶的水解度呈现先升高后降低再趋于平缓的趋势，在酶解3 h时水解度达到最大。随着酶解时间的延长，底物与酶的结合更加充分，水解度总体呈现上升的趋势；当酶解时间达到一定程度时，底物被消耗，酶解产物增多，酶分子的有效含量降低，导致水解度呈现下降趋势[23]。由此可得，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解时间分别为5 h和3 h。

2.2 鸡肉酶解条件响应面试验

2.2.1 响应面设计结果及方差分析

分别选择对水解度影响较大的3个因素进行响应面试验，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶试验设计及结果分别见表4和表5。采用多元回归拟合试验数据，得到水解度对自变量编码值的回归方程：Y1=29.69+1.62A+0.81B－1.36C+1.11AB+1.03AC－0.95BC－3.76A2－4.16B2－1.34C2。Y2=26.87－0.35A′－0.22B′－0.18C′－0.73A′B′－0.60A′C′－0.75B′C′－1.17A′2－1.16B′2－1.31C′2。

对回归模型进行方差分析，结果见表6和表7。

由表6和表7可知，两个模型的P值均小于0.000 1，失拟系数反映了模型的预测值与实际值之间的拟合程度。失拟项的P值分别为0.053 7（>0.05）和0.207 6（>0.05），说明该模型具有较好的拟合能力，此模型可用。相关系数R2分别为0.984 2和0.976 9，模型的校正RAdj2与预测R2相差较小（R2=0.984 2，RAdj2=0.963 9；R2=0.976 9，RAdj2=0.947 3），表明该模型可用来预测鸡肉的水解程度和优化酶解工艺。

对模型一次项、二次项、交互项的P值进行分析，其中一次项A、C和二次项A2、B2 、C2对响应值Y1（动物蛋白酶水解度）的影响极显著（P<0.01），交互项A′B′、A′C′、B′C′和二次项A′2、B′2、C′2对响应值Y2（木瓜蛋白酶水解度）的影响极显著（P<0.01）。因素对响应值的影响程度可以通过F值大小来判断，因此可得影响次序为酶添加量>pH值>酶解时间（动物蛋白酶）；酶添加量>酶解时间>酶解温度（木瓜蛋白酶）。

2.2.2 交互作用分析及验证试验

3D曲面图坡度越陡、等高线呈椭圆形且越密集，表明该交互项对鸡肉酶解工艺的影响越大[24]。由图6和图7可知，其水解度随因素水平的增加呈先上升后降低的趋势，与单因素试验结果相符；且等高线图整体呈椭圆形，表明存在显著的交互作用，该结果与方差分析结果一致。通过该模型得到最佳工艺条件：第一步为动物蛋白酶酶解5 h、酶添加量2.6%、pH 6.5，第二步为木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解温度60 ℃，水解度为30.16%。在此条件下通过3次重复试验，所得水解度平均值为（32.62±0.79）%，与预测值较接近，表明该工艺具有可行性。

2.2.3 双酶分步酶解顺序

在双酶分步酶解工艺中，采用不同的酶处理顺序对水解结果有一定的影响。根据动物蛋白酶和木瓜蛋白酶的试验结果，在其最优反应条件下，按照反应的先后次序对鸡肉进行分步酶解试验。由表8可知，先使用动物蛋白酶酶解，灭酶后再加入木瓜蛋白酶酶解水解度较高，选取此酶解顺序进行后续试验。

2.3 酶解液游离氨基酸分析

氨基酸作为蛋白质的主要组成成分和重要风味前体物质，其在食品中的种类和含量被作为一个重要指标来评价产品品质和感官特性[25]，按照呈味特征可以分为鲜味、甜味、苦味及无味氨基酸。对鸡肉酶解液中游离氨基酸进行分析，结果见表9。

鸡肉酶解液中游离氨基酸总量为6.02 mg/mL，呈味氨基酸总含量为5.75 mg/mL，占游离氨基酸总量的95.51%。其中鲜味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，含量分别占游离氨基酸总量的1.83%、4.98%，是鸡肉酶解液鲜味呈现的重要物质。甜味氨基酸占游离氨基酸总量的18.60%，甜味氨基酸本身具有的鲜味对酸味和苦味有一定的消减作用，并能与其他风味物质协同增鲜。苦味氨基酸占游离氨基酸总量的69.93%，此结果与Zheng等[26]、于亚辉等[27]的研究结果相似，在鸡肉酶解液中苦味氨基酸是主要的呈味氨基酸。在盐津乌骨鸡肉酶解液中共检测出7种人体必需氨基酸，其总含量为2.99 mg/mL，占游离氨基酸总量的49.67%，表明鸡肉酶解液具有较高的营养价值。

2.4 鸡肉酶解液中多肽分子量分布

最佳酶解工艺条件下鸡肉酶解液中多肽分子量的分布情况见图8。

由图8可知，5～10 kDa的肽含量仅为1.95%，而小于3 kDa的肽占91.33%，平均相对分子量为1 128 Da，酶解液的营养、呈味特性与其所含的小分子肽具有密切关系。此研究结果与侯钰柯等[28]利用肉杂鸡鸡骨架酶解后分子量分布具有相同趋势，小于1 kDa的分子量占比最高，酶解过程为后续美拉德反应奠定了良好的物质基础。Liang等[29]研究发现鸡汤中小于1 kDa的组分的鲜味较高，且小分子量組分的总体味道更加协调。吴明泽等[30]研究发现中华圆田螺肉中分子量小于1 kDa的肽抗氧化活性最强。

3 结论

本试验得到分步酶解盐津乌骨鸡肉最优工艺：先使用动物蛋白酶水解（酶解时间5 h、酶添加量2.6%、pH值6.5），灭酶后，再加入木瓜蛋白酶水解（酶解时间3 h、酶添加量2.5%、酶解温度60 ℃）。此条件下水解度可达（32.62±0.79）%，所得酶解液中的游离氨基酸种类丰富，总量达到6.02 mg/mL，其中人体必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的49.67%。此外，酶解产物中小于3 kDa的肽含量高于90%。酶解液中产生的游离氨基酸、多肽等呈味物质为盐津乌骨鸡肉调味产品的研发提供了理论依据。

参考文献：

[1]王麒淋，李广玉，郭爱伟，等.云南地方鸡种质资源现状与分子研究进展[J].湖北畜牧兽医，2021，42（4）：14-19.

[2]韩宗灿，周道荣，胡义，等.盐津乌骨鸡产业发展中存在的问题及对策[J].当代畜牧，2015（12）：71-72.

[3]肖智超，谷大海，杨晓丽，等.云南武定鸡、盐津乌骨鸡和大围山微型鸡肌肉中脂肪酸的组成分析[J].现代食品科技，2018，34（4）：121-128.

[4]相德才，赵智勇，张斌，等.盐津乌骨鸡ADFP、FATP1和ApoB基因表达量变化及其与脂肪性状的相关分析[J].中国畜牧杂志，2017，53（9）：33-37.

[5]汤龙，宋焕禄，王丽金.不同分子质量大豆蛋白和鸡肉酶解物的美拉德反应产物风味特征分析[J].食品科学技术学报，2023，41（3）：148-162.

[6]GAO J， FANG D L， MUINDE K B， et al. Analysis of umami taste substances of morel mushroom （Morchella sextelata） hydrolysates derived from different enzymatic systems[J].Food Chemistry，2021，362：130192.

[7]李自会，张顺棠，段晓杰，等.酶解禽类蛋白制备呈味基料的研究进展[J].中国调味品，2022，47（11）：211-215.

[8]孙颖，张莉莉，张玉玉，等.3种酶解液中游离氨基酸的分析[J].精细化工，2018，35（6）：1004-1008，1014.

[9]陈瑜，马剑锋，许丹，等.基于两步水解法制备三疣梭子蟹调味品的酶解工艺优化研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2022，48（3）：321-335.

[10]FU Y， LIU J， ZHANG W， et al. Exopeptidase treatment combined with Maillard reaction modification of protein hydrolysates derived from porcine muscle and plasma： structure-taste relationship[J].Food Chemistry，2020，306：125613.

[11]苏国万，黄可欣，何伟炜，等.酶解前后牡蛎风味变化的对比分析[J].现代食品科技，2020，36（7）：242-249.

[12]LI C J， TU Z C， LIU W Y， et al. Flavor substances of low-valued red swamp crayfish （Procambarus clarkii） hydrolysates derived from double enzymatic systems[J].Food Research International，2023，165：112461.

[13]桂海佳，李江龙，李泽林，等.基于双酶水解优化牛肉酶解液工艺及其呈味成分分析[J].中国调味品，2022，47（10）：103-109.

[14]胡文元，刘丽仙，佟荟全，等.不同月龄盐津乌骨鸡肉品质的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2016（7）：217-219，223.

[15]荀文，王桂瑛，赵文华，等.基于HS-SPME-GC-MS法比较瓢鸡和盐津乌骨鸡不同部位挥发性风味成分[J].核农学报，2021，35（4）：923-932.

[16]肖雪，王金浩，邵俊花，等.超声辅助酶法优化鸡肉蛋白水解工艺[J].食品研究与开发，2023，44（2）：124-131.

[17]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定：GB 5009.5—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[18]张庆春，余晓婉，相兴伟，等.复配酶法制备南极磷虾鲜味酶解液的工艺优化[J].食品工业科技，2022，43（2）：195-205.

[19]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定：GB 5009.124—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[20]邓宇，曹文红，陈忠琴，等.白贝肉酶解工艺的优化及其产物呈味特性研究[J].中国调味品，2023，48（3）：11-17.

[21]白云.鱼蛋白酶水解工艺条件优化及产物功能性研究[D].郑州：河南工业大学，2016.

[22]刘冰，周振，李若敏，等.双酶法制备条浒苔鲜味肽工艺研究[J].中国调味品，2021，46（4）：102-110，113.

[23]王梦娟，王灵昭，顾涵，等.南极磷虾自溶物深度酶解产物鲜味研究[J].中国调味品，2023，48（1）：75-79.

[24]李泽林，王秋婷，郭其洪，等.鸡骨液酶解工艺优化及其酶解前后风味物质分析[J].食品工业科技，2022，43（10）：206-215.

[25]谢晓霞.文蛤与蓝蛤鲜味肽的呈味特性及其与鲜味受体T1R1/T1R3的分子作用研究[D].锦州：渤海大学，2019.

[26]ZHENG J Y， TAO N P， GONG J， et al. Comparison of non-volatile taste-active compounds between the cooked meats of pre- and post-spawning Yangtze Coilia ectenes[J].Fisheries Science，2015，81（3）：559-568.

[27]于亚辉，陈沁雯，李晓婷，等.响应面法优化鸡肉蛋白酶解工艺[J].福建农业学报，2020，35（1）：80-89.

[28]侯钰柯，陆逸峰，蒋宇飞，等.肉杂鸡鸡骨架酶解工艺优化及其分析评价[J].食品工业科技，2022，43（9）：232-242.

[29]LIANG L， DUAN W， ZHANG J C， et al. Characterization and molecular docking study of taste peptides from chicken soup by sensory analysis combined with nano-LC-Q-TOF-MS/MS[J].Food Chemistry，2022，383：132455.

[30]吳明泽，王笑，胡祥昊，等.中华圆田螺肉抗氧化肽的分离纯化及小鼠体内外活性研究[J].食品与机械，2019，35（12）：151-157.