原子力显微镜对牙釉质脱矿再矿化的分析

郝丽英， 刘宇峰， 文莺惠， 郑赛男

（1.四川大学华西口腔医学院口腔疾病防治全国重点实验室，成都 610041；2.成都大学基础医学院，成都 610106）

0 引 言

牙釉质在有唾液存在的健康口腔环境中相对稳定，但在以细菌为主的多因素作用下，牙釉质的脱矿及再矿化作用在牙釉质-牙菌斑-唾液界面不断发生，出现脱矿与再矿化失衡，从而引起龋病的发生。此外，牙釉质脱矿还会引起牙齿中钙磷的损失［1］、牙釉质表面结构的脱矿［2］、牙齿显微硬度的降低［3］以及牙齿的龋坏［4-5］。因此，牙釉质的再矿化研究受到学者们的重视。再矿化定义为从口腔中获得的钙和磷离子沉积到脱矿的釉质晶体空隙中，从而产生矿物质累积的过程。钙、磷离子从唾液和菌斑液中重新沉积在脱矿的病变部位，形成新的羟基磷灰石，这些晶体更大，更耐酸溶解［6］，从而更有效地保护牙齿。因此，对牙釉质脱矿及再矿化分析尤为重要。目前，常用的牙釉质脱矿及再矿化分析方法主要包括扫描电子显微镜（SEM）和显微硬度分析。然而，SEM 测试需要对样本进行喷金的前处理且放大倍数有限，产生样本无法再次利用、形貌变化指标观察不清等问题。同时，显微硬度分析属于宏观指标分析，无法进行微观定量分析。此外，牙釉质脱矿还会引起细菌黏附，传统的分析方法无法进行黏附力的测试。因此，建立牙釉质脱矿及再矿化的分析实验尤为重要。

原子力显微镜（AFM）是一种观察材料表面微观形貌的精密仪器，通过测量样品表面分子（原子）与AFM 微悬臂探针之间的相互作用力，观测样品表面形貌和力学性质［7-8］。将一个对极微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触。由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力，使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描时，传感器检测出这些变化，从而获得作用力分布信息，然后通过控制／反馈系统，将作用力分布信息转化成分辨率较高的样品表面结构信息［9］。依据AFM 测试原理，对样本无须进行前处理，样本测试完后便可继续下一步的实验研究。此外，AFM 不仅可以提供较SEM 放大倍数更高的微观形貌，还可以提供相应的粗糙度值，甚至可以进行三维重建以及不同脱矿程度的细菌黏附力研究［10-11］。该技术不仅使得样本的微观形貌可视化，还可对粗糙度和细菌黏附力等进行量化分析，为实验教学以及科学研究提供了重要的技术手段［12］。

以脱矿离体牙和再矿化牙釉质为研究对象，通过原子力显微技术进行脱矿前后形貌差异的表征，并进行三维重建及粗糙度量化，使得形貌变化更为直观并附有量化信息。此外，采用口腔主要的致龋细菌变异链球菌（S.mutans）对AFM 探针进行修饰，分析变异链球菌对牙釉质脱矿及再矿化的黏附力，建立牙釉质脱矿及再矿化的分析方法，拓展AFM的功能。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：脱矿液，磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钾（KCl）、氯化钙（CaCl2）、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）。以上均为分析纯试剂，购自成都科龙试剂公司。脑心浸液培养基（BHI）购于英国Oxoid Ltd.公司，营养琼脂、蔗糖购于北京生物科技有限公司。实验所用水均为二次蒸馏水。轻敲模式探针型号为OMCL-AC240TS-C3，接触模式探针型号为TL-CONT。

仪器：硬组织切割机（Struers Minitom，丹麦）、显微硬度计（Struers Duramin-2，丹麦）、抛光机（Struters，丹麦）、超声清洗机（Autoscience，美国）、AFM（SPM-9600，岛津，日本）、场发射扫描电子显微镜（Inspect F，FEI，美国）。

1.2 牙釉质脱矿及再矿化实验

（1）牙釉质收集。收集华西口腔医院因正畸拔除的上下颌前磨牙15 颗，患者年龄在12 ～16 岁，无龋病，形态色泽正常，无明显裂纹，釉质发育良好，牙体健康，非氟斑牙和四环素牙。去除结石和软组织，洗净后放置在蒸馏水中，于4 ℃的冰箱内保存。

（2）切片和包埋。所有标本切除牙根，用锯式切片机平行于前磨牙颊面并距颊面约2 mm 处低速切片，取得厚度为2 mm 的釉质块。每颗牙分成2 个牙块，共30 个牙块。配制一定比例的环氧树脂胶，将分割好的牙块包埋，备用。

（3）打磨。将包埋好的牙块分别用400 目（目指1 in2面积内网孔数）、800 目、1 000 目、1 400 目、1 800目、2 000 目、2 500 目、3 000 目的砂纸打磨，下底面水平即可，牙釉质面要打磨平滑。在每个牙块釉面处留有3 mm×3 mm 的开窗区，其余部分用指甲油封闭。

（4）牙釉质脱矿实验。采用脱矿液进行牙釉质脱矿处理，随机挑选包埋打磨好的27 个牙块并随机分成3 组，每组9 个样本：A 组（对照组，不浸泡）、B 组（实验组，浸泡5 s）、C 组（实验组，浸泡15 s），处理完后将每个样本均使用清水冲洗约20 s，然后自然干燥后备用。

（5）脱矿牙釉质的再矿化实验。再矿化溶液配制：130 mmol／L KC1、1.5 mmol／L CaCl2、0.9 mmol／L KH2PO4、20 mmol／L HEPES，调节pH值至7.0［13］。

将上述3 组脱矿牙釉质（27 个，9 个／组）按矿化液浸泡时间不同再分为3 组，每组3 个样本：D 组（对照组，不浸泡）、E 组（实验组，浸泡3 d）、F 组（实验组，浸泡7 d）。浸泡完后用清水清洗干净，自然干燥后备用。

1.3 细菌培养

变异链球菌由四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室提供，按照细菌常规培养方法培养，获得细菌混悬液，进行探针的修饰［14］。

1.4 牙釉质脱矿及再矿化分析

采用AFM对牙釉质脱矿及再矿化进行形貌和粗糙度分析，并采用显微硬度计和场发射扫描电子显微镜对脱矿及再矿化牙釉质的显微硬度和形貌进行验证分析。

1.5 牙釉质脱矿及再矿化细菌黏附力分析

（1）探针制备［15］。采用无针尖探针，型号为TLCONT。将探针的悬臂梁尖端2／3 浸入质量分数为0.01%的多聚赖氨酸中3 min，取出自然干燥5 min，使得探针表面带有正电荷。将探针浸入制备好的变异链球菌悬液中，5 min后取出探针，自然晾干10 min，然后立即进行黏附力测试。

（2）黏附力测试。将牙釉质样本固定于样本台上，对细菌修饰的探针采用接触模式，在2 μm ×2 μm范围、1 Hz频率下进行黏附力测试。每个样本随机选取7 个位点，每个位点测量10 次。

1.6 统计分析

各组的粗糙度值表示为均值±标准差，采用t检验法进行两两比较。对于黏附力，每个位点采用平均法计算，7 个位点的数据采用中位数计算法获得最终的黏附力，最后采用Dunn’s 检验进行组间的两两比较分析。使用SPSS 19.0 软件进行各组差异比较分析，***p＜0.001 表示有极显著差异，**p＜0.01 表示有非常显著差异，*p＜0.05 表示有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 AFM对牙釉质脱矿及再矿化的形貌分析

图1 为牙釉质脱矿及再矿化的AFM 图。正常牙釉质的釉柱结构［见图1（a）］经过酸蚀处理5 s［见图1（d）］和15 s［见图1（g）］后，釉质表面损坏，呈现出鳞状的颗粒结构，表面凹凸不平，随着酸蚀时间的增加，鳞状颗粒越密，表面微观形态越粗糙。经再矿化液处理后［见图1（e）、（f）、（h）、（i）］，釉质上的微孔变少，表面有沉积物填充、覆盖，表面变得平整；釉质中大蜂窝孔消失，但仍有微孔存在，虽然釉面上矿物质重结晶增多，但是致密感依然不如未脱矿的牙釉质。随着再矿化时间增长，釉质表面更加平整、致密，覆盖物更多。综上表明，AFM可对牙釉质脱矿及再矿化的微观形貌进行分析。

图1 牙釉质脱矿及再矿化的AFM图

2.2 AFM对牙釉质脱矿及再矿化的量化分析

AFM可进一步对牙釉质的粗糙度进行量化分析，为实验教学和科学研究提供更直观的数据支撑。如图2（a）及表1 所示，随着酸蚀时间的增加，粗糙度增大，且组间均存在统计学差异。如图2（b）及表1 所示，随着再矿化时间的增加，粗糙度呈现降低的趋势，表明酸蚀时间越长，牙釉质表面破坏程度越大，再矿化可以对牙釉质表面有一定的修复作用，而且再矿化时间越长，对牙釉质的修复效果越好。根据表2、3 的统计分析，相同脱矿时间下牙釉质经过不同时间的再矿化处理后，粗糙度两两比较均有统计学差异；不同脱矿时间下牙釉质经过相同时间的再矿化处理后，粗糙度两两比较也均有统计学差异。

表1 不同脱矿处理的牙釉质在不同再矿化时间下的粗糙度值

表3 不同再矿化时间下的牙釉质表面粗糙度比较

2.3 SEM和显微硬度测试对牙釉质脱矿及再矿化的验证

选用SEM对牙釉质脱矿及再矿化的形貌进行表征。如图3 所示，正常牙釉质表面致密平整［见图3（a）］，当脱矿5 s后［见图3（d）］，釉柱结构被酸溶解，牙釉质表面呈现疏松状态，脱矿时间越长牙釉质表面被酸溶解越严重［见图3（g）］。当脱矿牙釉质经过再矿化处理后，牙釉质表面沉积一层絮状矿物质，表面变得平整、致密，并随着再矿化时间的增加，牙釉质表面变得更为平整、致密。脱矿牙釉质在再矿化液处理下，再矿化液中钙、磷离子累积所形成的羟基磷灰石晶体覆盖于牙釉质表面，使牙釉质表面更加平整、致密。SEM 形貌表征结果与AFM 形貌表征结果一致，但是在SEM测试前需要对样本进行喷金处理，造成样本无法重复利用，而且不能提供相应的粗糙度值。

图3 牙釉质脱矿及再矿化后的SEM图

此外，采用显微硬度测试进一步验证粗糙度。由不同时间脱矿后牙釉质表面显微硬度图（见图4）可见，脱矿5 s组［见图4（b）］较脱矿0 s组［见图4（a）］菱形图案变大，脱矿15 s 组［见图4（c）］菱形图案更大。由图4（d）的硬度值分析可知，随着脱矿时间的增长，牙釉质表面逐渐由紧致变得疏松，牙釉质表面的显微硬度也随之降低。柱状图［见图4（d）］分析表明，脱矿时间5 s组、脱矿时间15 s 组均具有统计学意义（**p＜0.01）。脱矿时间5 s 组和0 s 组相比，脱矿时间5 s组具有明显的统计学差异（***p＜0.001）。脱矿时间15 s 组显微硬度更低，存在明显的统计学差异（***p＜0.001），表明脱矿后牙釉质的釉柱和柱间质流失，釉质崩塌，硬度降低，脱矿时间越长牙釉质表面显微硬度越低，与AFM 的粗糙度分析结果一致。图4中，1 VHN ＝9.807 MPa。

由表4 可知，随着再矿化时间的增加，牙釉质的形态逐渐由疏松变得紧致，牙釉质表面的显微硬度也随之升高。由图5 和表5、6 可知，在相同的脱矿时间下，再矿化3 d和7 d组较未再矿化组均存在统计学差异，再矿化时间越长差异越大，表明再矿化液对脱矿后牙釉质的表面显微硬度有一定的恢复效果，再矿化时间越长显微硬度越大。以上结果与AFM 再矿化后的粗糙度值分析结果一致，验证AFM量化测试的可行性。

表4 不同脱矿时间、再矿化时间下牙釉质表面硬度值

表5 不同脱矿化时间下牙釉质表面硬度比较

表6 不同再矿化时间下牙釉质表面硬度比较

图5 脱矿牙釉质再矿化的硬度柱状图

2.4 AFM对牙釉质脱矿及再矿化的细菌黏附力分析

变异链球菌和不同脱矿时间下牙釉质表面黏附力曲线如图6（a）所示。由曲线的后退部分（红色）可以看出，变异链球菌和不同脱矿时间下牙釉质黏附力具有明显的差异。当细菌修饰的探针慢慢接近被研究的牙釉质，两者之间距离为500 nm 左右时，探针受到指数增加的排斥力（红色线），被迫离开牙釉质表面。由于细菌与牙釉质存在一定的黏附力，使得探针悬臂梁发生形变，再离开一定距离后，细菌和牙釉质之间的结合断裂，从而产生最大的黏附峰（黏附力）。由于不同脱矿时间的牙釉质表面粗糙度存在统计学差异，因此细菌和牙釉质间的结合力也不一样，探针悬臂梁产生的最大弹性形变也不相同。力曲线［见图6（a）］和定量分析柱状图［见图6（b）］表明，变异链球菌对不同脱矿时间的牙釉质均存在表面黏附力，随着粗糙度的增加黏附力增大，并存在明显的统计学差异。这可能是由于：粗糙度越大，牙釉质表面的黏附位点越多，为细菌黏附提供更多位点凹陷的表面结构，也可为细菌提供更多的生存空间，更有利于细菌的黏附。当脱矿牙釉质经过再矿化处理后，由于牙釉质表面形成了一些羟基磷灰石晶体，使得表面粗糙度有所降低。同时，由定量分析柱状图（见图7）可知，对相同再矿化时间的牙釉质而言［见图7（a）］，脱矿严重的牙釉质的细菌黏附力依然较高，但均低于未再矿化处理组；对相同脱矿时间的牙釉质而言［见图7（b）］，随着再矿化时间的增加，细菌黏附力降低，尤其是脱矿15 s 的牙釉质经过再矿化处理后，细菌黏附力降低更为显著，但是均高于未脱矿的黏附力，表明粗糙度影响细菌对牙釉质的黏附力，并且再矿化处理有助于降低细菌黏附力，从而有效降低患龋病的概率。

图6 变异链球菌和不同脱矿时间下牙釉质表面黏附力分析

图7 变异链球菌和不同脱矿时间、再矿化时间下牙釉质表面黏附力柱状图

3 结 语

AFM为牙釉质脱矿及再矿化分析提供直观成像和数据量化的技术支持。通过AFM 技术分析脱矿及再矿化处理的牙釉质形貌、粗糙度变化，进一步利用AFM技术研究口腔致龋菌变异链球菌对脱矿及再矿化牙釉质的黏附力。结果表明，随着酸蚀时间的增加，牙釉质表面出现鳞状颗粒，结构疏松，粗糙度变大，细菌黏附力增加；经过再矿化处理后，牙釉质表面变得更为致密，粗糙度和黏附力均有所降低。同时，采用SEM和显微硬度仪从形貌和硬度两方面验证了AFM成像和量化数据的可靠性。