13-顺维甲酸体外诱导神经母细胞瘤干细胞分化的体外实验

刘秋霞 蔡娇阳 李本尚 汤静燕

神经母细胞瘤(NB)是起源于神经嵴的儿童外周神经系统肿瘤，占儿童实体瘤的8%～10%。随着化疗方案的改进及综合治疗的开展，许多儿童肿瘤的预后明显改善，但NB患儿的预后没有显著提高，特别是晚期患儿的转移率、复发率较高，长期生存率不到40%[1]。肿瘤干细胞(TSC)假说认为，肿瘤组织中存在一群与干细胞有相似特性的细胞，称为TSC[2]；这群细胞具有无限增殖和多向分化的能力，决定了肿瘤的发生和演变。TSC与肿瘤的发生、转移、复发和耐药都有密切的联系。可以推测晚期NB患儿中的TSC是其预后较差的原因之一。已有实验证实，正常神经干细胞在添加生长因子的无血清培养基中，能分裂增殖为多细胞克隆球，形成三维球状结构的神经球，此神经球中富集干细胞和祖细胞[3]。Hansford等[4]报道无血清培养原代NB细胞形成的神经球具有干细胞特性，10个成球细胞就可以使非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/SCID)小鼠成瘤。本研究通过体外观察和鉴定13-顺维甲酸对NB干细胞的诱导分化作用，为临床应用13-顺维甲酸治疗NB微小残留病灶提供了实验依据。

1 方法

1.1 材料 DMEM /F12培养基、B27和0.25%胰酶购于GIBCO公司；人表皮生长因子(EGF)和人碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购于Promega公司；Ex-TaqPCR试剂盒购于TaKaRa公司；Poly-D-Lysine和13-顺维甲酸购于Sigma公司；鼠抗人nestin 单克隆抗体购于ABcam公司；Cy3标记羊抗鼠IgG二抗购自Jackson Immunoresearch Laboratories公司。

1.2 神经球的培养、分离纯化及诱导分化 共收集到14例伴骨髓转移(骨髓涂片可见成团的肿瘤细胞，流式分析CD56+CD81+CD45-的细胞为NB细胞)的Ⅳ期NB患儿的骨髓液标本，各取骨髓液3 mL，用Ficoll分离液分离出的单个核细胞置入25 cm2培养瓶中，重悬于无血清培养基(DMEM/F12培养基，含20 μmol·L-1EGF、20 μmol·L-1bFGF和2%B27)，调整细胞浓度为1×105·mL-1，于37℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养。每3 d向培养瓶中滴加新鲜无血清培养基，采用机械法轻轻打散细胞，每7 d按1∶3比例传代1次。

为了解最适合的13-顺维甲酸浓度和分化时间，本研究以不同浓度13-顺维甲酸和诱导时间进行预实验。简述如下：6孔板中分别添加0.1 、0.5、1、5、10和20 μmol·L-1的13-顺维甲酸，分别在0、3、6、9、12 和15 d观察细胞生长情况，发现含10 及20 μmol·L-113-顺维甲酸的细胞很快死亡，而0.1、0.5、1和5 μmol·L-113-顺维甲酸的细胞随诱导时间的延长，渐分化，以5 μmol·L-1最显著，含5 μmol·L-113-顺维甲酸的细胞诱导至9 d后，细胞颗粒逐渐增多，12～15 d细胞逐渐死亡。根据预实验结果，选择5 μmol·L-113-顺维甲酸，以3及9 d作为诱导分化观察时间点进行研究。

用400目的筛网轻轻过滤含有神经球的培养液，收集未滤过筛网的神经球，机械法打散神经球细胞后，在含10%FBS的DMEM/F12血清培养基中培养过夜，细胞贴壁后，次日添加5 μmol·L-113-顺维甲酸(DEMO溶解，DEMO终浓度<1‰)，每3 d胰酶消化和传代，并添加5 μmol·L-113-顺维甲酸。

1.3 RT-PCR法检测神经球细胞Oct-4的表达 Trizol法分别提取未经诱导、诱导3和9 d的3组NB神经球细胞的总RNA。RNA经浓度测定和电泳质检后，按照Promega反转录试剂盒要求进行反转录得到cDNA。然后，PCR检测干细胞特异表达基因Oct-4表达水平，以GAPDH为内参。

目的基因Oct-4的引物序列为：

正向 5′-GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA-3′；

反向5′-TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3′；

片段长度为218 bp。

内参GAPDH的引物序列为：

正向5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′；

反向5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′；

片段长度为99 bp。

PCR反应体系为20 μL，其中模板cDNA 1 μL；Ex Taq 酶0.125 μL；10×Ex Taq buffer 2 μL；dNTP mixture 2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；灭菌蒸馏水补足至20 μL。将PCR管放入Eppendorf PCR仪，设定反应条件：94℃ 5 min；然后94℃ 30 s，退火温度 30 s，72℃ 30 s循环，Oct-4、GAPDH的退火温度分别为50℃和56℃，Oct-4循环30次，GAPDH循环25次；最后72℃延长2 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较诱导后神经球细胞Oct-4的表达变化。

1.4 细胞免疫荧光检测诱导前后巢蛋白(nestin)的表达变化 将未经诱导分化的神经球细胞和5 μmol·L-113-顺维甲酸诱导9 d的细胞，置入1%FBS的DMEM/F12培养基中，浓度调整为1×105·mL-1，将Poly-D-Lysine处理过的无菌盖玻片放入24孔板，分别滴加两组细胞各2 mL，8 h后细胞贴壁，无菌镊子取出盖玻片。

将盖玻片分别用冰冷的3.7%的多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后用含0.1%Triton X-100的PBS溶液破膜30 min；5%BSA室温封闭1 h，加nestin一抗(1∶200)，室温孵育2 h；然后用PBS洗涤5次，每次5 min；室温下再次用5%BSA封闭1 h，随后加入Cy3标记二抗(1∶2 000)，室温避光结合30 min；最后，DAPI(1∶1 000)避光染核10 min。PBS清洗3次，每次5 min。待盖玻片自然干燥后，封片，荧光显微镜下观察并拍照。设不加一抗组作为阴性对照。

2 结果

2.1 NB神经球的培养及诱导分化 14例骨髓液标本中，4例分离到原代NB细胞，在无血清培养基中培养4～6 d后，可见悬浮神经球形成，传代后，成球细胞能再次分裂增殖为神经球，其中2例连续稳定传代(骨髓中肿瘤细胞>90%)，另外2例在不断传代中逐渐贴壁、分化。

神经球细胞在血清培养基中开始贴壁生长，呈三角形或星形，细胞突起钝且短(图1A)；添加5 μmol·L-113-顺维甲酸诱导后，细胞的生长速度降低，形态发生了明显的变化，细胞突起增多和变长，逐渐连接成网(图1B～D)。

图1 NB神经球的培养及诱导分化

Fig 1 The culture and differentiation of neurosphere cells

Notes A：Neuroblastoma cells from bone marrow aspirates formed nonadherent spheres after growing in serum-free stem cell conditions for 4-6 days；B,C,D：The morphology of neurosphere cells before induction, 3 days and 9 days after induction respectively. Neurosphere cells were cultured in differentiation medium supplemented with 5 μmol·L-113-cis-retinoic acid. The cells attached to the bottom of the culture dish and protruded cell processes. Most of the cells gained a neuronal morphology and the processes grew much more and longer, then reached into a network

2.2 RT-PCR法检测NB神经球Oct-4的表达及13-顺维甲酸诱导后表达的改变 RT-PCR法检测到未分化的NB神经球细胞表达Oct-4，13-顺维甲酸诱导3 d后，其表达降低，诱导9 d后Oct-4表达消失(图2)。

图2 RT-PCR法检测13-顺维甲酸诱导后NB神经球细胞Oct-4的表达

Fig 2 Oct-4 expression of neurosphere cells during the induction detected by RT-PCR

Notes Lane 1 to 3: showing the corresponding GAPDH expression as control;Lane 4 to 6: denoting Oct-4 gene expression of neurosphere cells before induction, 3 and 9 days after induction respectively, the expression level of Oct-4 was decreased with the duration of using 13-cis-retinoic acid increased

2.3 细胞免疫荧光检测NB神经球13-顺维甲酸诱导后nestin的表达 未经13-顺维甲酸诱导的NB神经球细胞表达nestin(图3A)，提示神经球细胞中含有TSC，13-顺维甲酸诱导9 d后，nestin的表达已经明显减弱(图3B)，提示TSC已经分化。

图3 细胞免疫荧光检测13-顺维甲酸诱导后NB神经球细胞nestin的表达

Fig 3 Nestin expression of neurosphere cells during the induction detected by cell immunofluorescence

Notes A：Neurosphere cells were positive for nestin before induction；B：Induced by 13-cis-retinoic acid for 9 days neurosphere cells expressed less nestin

3 讨论

随着TSC假说得到越来越多证据的证实，肿瘤的治疗理念也发生了改变，真正有效的治疗可以针对TSC。传统的放、化疗治疗恶性肿瘤主要针对肿瘤中的快速增殖细胞，而不是TSC。虽然短期内肿瘤快速缩小，但远期疗效不佳，复发率较高。原因首先是TSC处于相对静止期，偶尔进入细胞周期；再者，TSC表达ABCG2、抗凋亡蛋白，具有增强的DNA修复能力[5]，比成熟分化细胞更有耐药性。TSC的治疗方法除了通过依赖TSC表面抗原及信号通路中的关键分子来抑制或消除TSC外，另一个有效方法是诱导TSC分化。

高危NB患儿经过诱导化疗和清髓性巩固治疗后，大部分还会复发，提示清髓性巩固治疗后很可能还存在含有TSC的微小残留病灶。许多诱导剂如维甲酸、AMP和神经营养因子等均能诱导人NB细胞株的轴突生长[6]，其中维甲酸主要作用于RAR和RXR两种受体，是最有潜力的NB微小残留病灶的诱导剂，能诱导体内细胞分化，同时伴有肿瘤细胞增殖减低[7]。CCG(Children Cancer Group，儿童肿瘤协作组)的一项RCT研究显示，接受移植后给予13-顺维甲酸治疗的患儿无事件生存率显著提高[(46%±6%)vs(29%±6%)，P=0.027]， 对骨髓移植后存在微小残留病灶的患儿有治疗效果[8]。其他的维甲酸，如9-顺维甲酸、全反式维甲酸和芬维A胺对高危NB患儿的微小残留病灶也具有活性。

Oct-4的表达只限于多能干细胞，随着分化的启动及多能性的丧失，其表达水平逐渐降低[9，10]。Nestin是一种中等纤维蛋白，被广泛应用于神经干细胞和祖细胞的特异性标记分子[11]。本研究用无血清培养基体外培养NB细胞，形成富集TSC的悬浮神经球，证实13-顺维甲酸能诱导神经球细胞分化，随诱导时间的延长，干细胞基因Oct-4和神经前体细胞标记nestin的表达逐渐降低，提示13-顺维甲酸能有效诱导分化TSC，为临床将维甲酸用于NB的维持治疗提供了实验依据。

维甲酸能诱导细胞分化已得到了大量实验的证实，本研究从TSC角度论证了13-顺维甲酸是有效的TSC诱导剂，为研究维甲酸治疗NB的作用机制提供了新的线索，同时也为肿瘤的治疗带来新的理念。但本研究为体外实验结果，距离临床应用尚需进一步实验研究。

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