反向遗传学在植物研究中的应用

撰文/闫晓丹*

1、反向遗传学及其技术介绍

反向遗传学（reverse genetics）是相对于正向（经典）遗传学而提出的。经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验开始的，就是通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发展规律的。即正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。反向遗传学则是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应。即反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生物生命发生的本质现象与规律，如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。

而与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术（r e v e r s e g e n e t i c s approach），包括RNA 干扰（RNA interference ,RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA 重组技术应用范围的扩展与延伸。随着基因组序列测定技术的日渐成熟，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用，尤其是RNA 病毒的研究方面。

2、反向遗传学的应用

2.1 用于拯救病毒或创造新型病毒 根据一些病毒的有关的已知核酸序列，采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒，这给获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了一个全新的途径。也可在生产疫苗时，将流行毒株与高产毒株进行基因重配，得到同时具有高产特性和流行毒株抗原性的重组毒株，以提高疫苗产量。此外，由病毒的cDNA体外转录来获得拯救病毒是研究RNA 病毒致病机制的有效手段。最早人们利用体外连接的方法将小片段的反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）产物连接起来，构建成病毒基因组全长的cDNA，并以此为模板进行体外转录，然后转染易感细胞以获得感染性的拯救病毒。近年来长链RT-PCR 技术发展迅速，使一次性扩增出病毒基因组全长的cDNA，并直接以扩增产物为模板来获得拯救病毒成为可能。

2.2 用于负股RNA病毒的研究 反向遗传学技术通过构建含有特定序列的感染性RNA病毒，在DNA 分子水平上对RNA 病毒感染性克隆进行体外操作，从而研究这些病毒特定蛋白的结构和功能、病毒各成分之间及病毒与细胞间相互作用、病毒致病机制、构建病毒载体及活疫苗的生产等。该技术最先是在正链RNA病毒上得到成功使用的。目前，已经获得了脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、烟草花叶病毒、登革病毒等的感染性分子克隆，且小RNA 病毒、黄病毒、甲病毒等正链RNA 病毒作为载体表达异源病毒蛋白的尝试也取得了重大进展。

2.3 反向遗传学研究的重要方法RNA干扰技术的应用 生物的每个组织、细胞所携带的遗传信息是完全一致的，然而其形状、功能和蛋白质组成等具有明显不同，这都是由基因表达调控的时空性所导致的。基因表达的调控有转录前调控（即调控靶基因DNA）和转录后调控（即调控靶基因mRNA）两种途径。内源性双链RNA干扰（double-strand RNA interference, dsRNAi）技术和反义RNA技术是调控靶基因mRNA的重要方式。RNAi是生物细胞内普遍存在的对抗病毒基因、转座子或人工转入基因所表达的mRNA 等外源基因的侵害，调控自身基因表达以防范疾病的一种自我保护现象，其提供了一种特异性失活功能基因的方法。它是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后，使该mRNA发生特异性的降解，导致其基因表达的沉默，即转录后基因沉默。

RNAi 技术是反向遗传学研究的重要手段，其在抗病毒、稳定转座子和参与胚胎发育等方面具有重要的生物学功能。在功能基因组的研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低的突变以确定其功能。由于RNAi 具有高度的序列专一性，可以特异的使特定基因沉默，从而获得功能丧失或降低的突变。因此，RNAi 可作为功能基因组研究的强有力的手段。与目前基因治疗中常用的方法如反义RNA技术或转入没有功能的突变体相比，RNAi对基因表达的抑制具有高效、特异、简便易行的特点。因此，RNAi 在人类功能基因组研究和疾病治疗上也有很大的应用潜力。在植物中，RNAi 不仅作为一种防御机制，而且在植物发育过程中，通过使DNA甲基化或使染色质结构改变等参与内源基因的表达调控。

2.4 用于基因方面的研究 反向遗传技术在病毒、动物、植物等基因研究方面具有重大应用价值,并取得了较大进展。一部分用于研究高等动植物相关基因功能:一些高等动、植物（如人类、水稻和Arabidopsis）测序完成后,最具有挑战性的工作就是确定所有基因序列的生物学功能,通过基因突变、删除等,利用反向遗传学方法来研究未知基因的功能已受到研究者的广泛关注。也可用该方法研究致使植物杂交不育与杂交失活相关基因的功能,是物种形成的遗传学研究的良好工具。另一部分用于基因的克隆测序与定位:用反向遗传学途径克隆新基因是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现,以图位克隆与转座子标签技术为常见。随着现代生物信息学的发展,出现了更为便捷的电子克隆（silicon cloning）方法。还可以用于研究动、植物细胞内DNA 的同源重组,基因序列分析，可在DNA的分子水平上构建嵌合病毒以研究病毒基因组的基因功能。此外,反向遗传技术也被用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用关系等方面。

3、反向遗传学应用中存在的问题

反向遗传学技术是随着分子生物学技术尤其是DNA 重组技术的发展而建立起来的一门技术,在各科学研究领域里具有广阔的应用潜力。随着对生物分子水平的认识与了解, 以及人类和其他生物基因组测序、分析的完成,直接从遗传物质着手来研究解释生命本质与现象将变得越来越便捷、省时,在利用反向遗传学技术为人类健康、生存服务的同时,也应加以高度的警惕,避免构造出对社会和人类健康造成威胁的病毒株或生物。目前，反向遗传学在植物中的应用还不十分广泛，因此，反向遗传学在植物中如何应用，对于植物育种学家而言即是机遇也是挑战。