钙激活氯通道与哮喘黏液过度分泌及气道炎症的关系

姜轶飞， 沈华浩

(浙江大学医学院附属第二医院呼吸科，浙江 杭州 310009)

#现工作单位:浙江省嘉兴市第二医院呼吸科，浙江嘉兴 314000

哮喘的一个重要特征是杯状细胞增生和黏液过度分泌，大量黏液难以清除引起小气道阻塞并导致气道高反应性，急性哮喘死亡患者尸检显示大小气道均有杯状细胞增生和黏液过度分泌，这种黏液过度分泌导致的气道阻塞是重症哮喘主要死因之一，有研究证实黏液过度分泌是第1秒用力呼气容积(FEV1)下降加速的独立危险因素［1］。一直以来黏蛋白(mucin，MUC)基因被认为是哮喘患者中调控杯状细胞黏液分泌的主要基因，但近年来一个新的基因－钙激活氯离子通道基因在哮喘黏液分泌中的作用逐渐被人们认识，进一步的研究还发现其与哮喘的气道炎症形成有相关性。抑制该基因调控的钙激活氯离子通道不仅能控制哮喘的黏液分泌还能抑制血管旁气道组织炎症。现在有大量文献通过描述该基因的表达来反映气道杯状细胞的黏液高分泌状态，该基因与哮喘致病性的相关研究也取得了很大进展，但也有研究从不同角度指出不同观点。本文简要介绍钙激活氯离子通道的结构和特点，及该通道与哮喘黏液分泌和气道炎症的相关性和一些最新研究进展。

1 钙激活氯离子通道的结构和特点

氯离子是体内含量最大的负离子，氯离子通道是指分布于细胞膜和细胞器质膜上的一种跨膜蛋白，一般是由几个结构域组成的多次跨膜结构，对氯离子和其它阴离子如碘离子(iodide ion，I－)、硝酸根离子(nitrate ion，NO3－)、硫氰酸根离子(thiocyanate ion，SCN－)、氟离子(fluoride ion，F－)有通透性，有时运转其它阴离子反而更有效。按照氯离子通道开启关闭的调节因素差异可分为以下几类:电压门控氯通道家族、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophostate，cAMP)/蛋白激酶A激活的氯通道、钙激活氯通道、容量调节氯通道、配体激活氯通道和细胞内氯通道家族。它参与细胞的电荷和离子传输，有调节pH值、细胞容量大小、细胞兴奋性和细胞发育凋亡的功能。

钙激活氯通道(calcium－activated chloride channels，CaCC;或 chloride channels，calcium activated，CLCA)广泛分布于自然界各种生物中，在人体和小鼠的多种组织中介导钙离子来激活氯通道，由国际基因命名系统(international system for gene nomencalture，ISGN)命名，是一个近年来发现的新的蛋白家族。目前这一家族在6个哺乳动物中有15个成员［2］，其中bCLCA1和bCLCA2在牛类表达;mCLCA1、mCLCA2、mCLCA3(Gob －5，因与杯状细胞Goblet cell 相关而命名)、mCLCA4、mCLCA5、mCLCA6在鼠类表达;而人类主要表达 hCLCA1、hCLCA2、hCLCA 3、hCLCA4;此外在猪、马中也有该基因表达。

钙激活氯通道在许多生理过程中起重要的作用，如分泌蛋白和盐的跨上皮转运、神经元兴奋、平滑肌生理特性的维持、卵母细胞受精和心脏动作电位复极化。钙激活氯通道的通道蛋白孔内对阴离子结合位点较弱，故对除氯离子之外的许多阴离子均有通透性，且特异性识别能力较差，因正常情况下，阴离子以氯离子为主，故称之为钙激活氯通道。在不同物种和不同组织中，激活所需要的游离钙离子浓度也不同，该通道的物理特性呈现时间和电压特异性，当胞内 Ca2+浓度 ＜1 μmol/L时，该通道为单向通道，而当胞内Ca2+浓度＞1 μmol/L时，则通道完全打开呈现出双向导通性［3］。Ca2+对通道的调节有可能通过直接结合通道的位点来控制通道开放;或通过钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ产生的钙依赖磷酸化途径。钙激活氯通道的单通道调节具有多样性，这预示着存在多个CaCC异构体和其在正常生理情况下起着重要的调节作用。钙激活氯通道的激活机制包括细胞内钙库释放 Ca2+，胞外 Ca2+内流和Na+/Ca2+交换，结构－功能研究表明离子载体伊屋诺霉素能诱导钙激活氯通道蛋白表达引起的氯离子电流，目前尚未发现特异性的阻断剂，但9－AC、尼氟灭酸(niflumic acid，NFA)、DCDPC、DIDS 都能部分阻断该通道。其中NFA是目前公认的较为常用的阻断剂［4］，Nakano等［5］证实 NFA 不仅能抑制 IL －13诱导的杯状细胞增生而且能抑制哮喘的气道高反应性和嗜酸粒细胞浸润，IL－13能上调mCLCA3和hCLCA1的表达。

小鼠mCLCA3(Gob－5)和人hCLCA1是异种同源通道蛋白，两者之间有75%的相似度。mCLCA3是4次跨膜糖蛋白，有3个胞外段，分别为氨基酸胞外段、中间胞外段和羧基胞外段。mCLCA3 cDNA全长2931 bp，开放读框编码913个氨基酸残基。Gob－5主要分布在在胃肠道、呼吸道的黏液颗粒膜，尿道杯状上皮和其它产生黏液的细胞上，提示它可能与黏液的合成、聚集、分泌相关［6］。

2 调节钙激活氯通道的机制

调节Gob－5基因的因素尚不完全明确，该基因起作用的方式也不是很清楚，对于其产生作用的假设是基于其氯通道的结构，但是体外研究利用培养细胞系统(NCI－H292、Caco－2)显示 hCLCA1和Gob－5的过度表达诱导了MUC5AC的转录和分泌［7］。

IL－9是决定哮喘易感性的重要Th2细胞因子，过度表达IL－9的小鼠表现出很多人类哮喘的特征。通过抑制消减杂交(supression subtractive hybridization，SSH)技术分析IL－9转基因小鼠和对照组，发现Gob－5能被IL－9转基因小鼠特异性地诱导，IL－9和其它Th2细胞因子IL－4、IL－13滴注小鼠同样能诱导Gob－5的表达，滴注IFN－γ和Th1细胞因子则没有这个作用。进一步研究显示这种暴露于抗原诱导的Gob－5表达能被IL－9抗体治疗所抑制，提示IL－9在哮喘模型中是诱导Gob－5的重要条件。最后，该研究显示Th2细胞因子在体外人原代肺细胞中诱导了hCLCA1的表达。这些数据均强烈说明hCLCA1和Gob－5参与了Th2介导的哮喘病理生理过程［8］。另外也有研究认为Gob－5基因的表达由其它Th2细胞因子如IL－13调节的，IL－13促进了杯状细胞增生和黏液分泌［9］。mCLCA3基因的5'调控区被认为包含1个stat6的转录因子的结合位点，这个转录因子能介导IL－13的转导［10］。

组胺在黏液分泌、黏膜水肿和平滑肌收缩中起中心的作用，它是一种强烈刺激杯状细胞增生的化学物质，有报道称组胺能调节T细胞介导的免疫反应，IgE介导免疫反应的主要效应细胞－肥大细胞和嗜碱粒细胞通过分泌组胺来调节免疫反应。Yamauchi等［11，12］在 2008 年和 2009 年比较了组胺基因敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)和OVA致敏野生型小鼠(C57BL/6N)，结果显示组胺基因敲除哮喘老鼠气道的嗜酸性粒细胞比例明显低于对照组，但是上皮杯状细胞比例、Gob－5基因和MUC5AC基因的RNA水平明显高于野生型哮喘小鼠。这一结果提示组胺可能通过抑制杯状细胞增生和Gob－5的RNA水平而对气道急性炎症起调节作用。2组小鼠的TNF－α、IL－4、IL－5、IL－13和 IFN－γ均比生理盐水组有所增高，但是组胺敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)中的TNF－α比相同条件下的对照组有明显增高，提示组胺通过Th2细胞因子起调节作用。Zhao等［13］的研究也证明通过抑制Th2细胞因子治疗哮喘的药物糖皮质激素(地塞米松)能抑制哮喘小鼠BALF中Gob－5的RNA的表达和蛋白分泌。

3 钙激活氯离子通道与哮喘黏液分泌和气道炎症的关系

2001年Nakanish等［7］首先利用SSH技术在过敏性哮喘小鼠模型的肺中确定了1个特异性引起气道高反应性基因－Gob－5。之前Komiya等［14］报道Gob－5基因在小肠、结肠、胃和尿道中大量表达，在气道组织中只有少量表达，Nakanish等［7］则证实了Gob－5在气道高反应性模型小鼠中大量表达，并且Gob－5的表达产物主要分布在分泌黏液的杯状细胞中。在气道高反应性小鼠模型的气道内滴注Gob－5反义RNA显著抑制了气道高反应性和黏液分泌等哮喘表现，反之利用腺病毒载体在上皮中过度表达Gob－5基因则恶化了哮喘的上述表现。Nakanish等［7］进一步利用 hCLCA1导入人黏液上皮系细胞NCI－H292后，诱导了黏液产生和MUC5AC的表达。MUC基因的上调与杯状细胞的增生有关，被认为是气道杯状细胞增生的标志，MUC基因编码了各种黏液的糖蛋白，它包括1组基因(例如MUC1，MUC2和MUC4)，MUC5AC、MUC2和MUC5B是主要在气道内表达的基因，在哮喘患者和哮喘动物模型的组织中，MUC5AC的水平均有显著的增高。Gob－5在人类黏液表皮样细胞NCI－H292中能诱导MUC5表达的增加，被认为是黏液细胞化生和过度增生的第1步。气道上皮Gob－5的过度表达加重了哮喘小鼠模型的气道高反应性，并促使杯状细胞增生，黏液过度产生和嗜酸粒细胞浸润。

小鼠中的Gob－5基因对应人类中的hCACL1基因，研究报道hCACL1基因的过度表达恶化了哮喘。hCLCA1在疾病中的病理生理依据主要来源于2个方面:首先，临床研究提示COPD、哮喘和肺囊性纤维化病人体内的hCLCA1表达增高［15］，其次基因分析显示hCLCA1和4种哮喘的表现相关(支气管反应性、皮肤划痕实验、总IgE、嗜酸粒细胞计数)，进一步的hCLCA基因SNP分析显示其与COPD、成人和儿童哮喘有相关性［16］。

2005年Long等［17］用OVA致敏 Gob－5基因敲除小鼠发现BALF的炎症比对照组小鼠明显增强，构成BALF炎症的主要细胞是中性粒细胞，Gob－5基因敲除小鼠的血管旁组织炎症、杯状细胞增生、黏液过度分泌则明显下降，乙酰甲胆碱激发后，Gob－5基因敲除小鼠的气道高反应性显著好于对照组。气道内注入LPS后，Gob－5基因敲除小鼠与对照组小鼠相比，BALF中性粒细胞炎症增强而血管旁组织炎症减少，对黏液分泌和杯状细胞增生则几乎没有什么作用，这证实了过敏性免疫反应中Gob－5与杯状细胞增生和黏液分泌的关系，同时提示Gob－5在启动免疫反应中与组织炎症相关。

但是Robichaud等［18］在2005年利用 Gob－5基因敲除小鼠建立的过敏性哮喘小鼠模型进行研究发现，用OVA和IL－13致敏的Gob－5基因敲除小鼠和对照小鼠在杯状细胞增生和气道炎症方面没有区别，体外实验用siRNA敲除CLCA－1的人肺上皮细胞也不能减少黏液表达，提示Gob－5的表达并非过敏性哮喘小鼠和体外细胞黏液分泌的必要条件。同时 Robichaud 等［18］研究了mCLCA1、mCLCA2 和mCLCA4，发现这些基因并不能代偿mCLCA3所起的作用。这和之前报道的结果［7，17］产生了矛盾，分析可能的原因是Gob－5并不直接分泌黏液，而是作为1个黏液分泌的启动因素起作用，当Gob－5基因被敲除后，机体有可能通过其它钙激活氯通道基因或者其它机制进行代偿，从而导致两者之间不产生差异，代偿机制的一个可能是2组之间有3倍差异的精氨酸酶，有文献［19－21］报道它可能会导致肺黏液分泌增加;另一个可能的原因是研究所用的小鼠基因背景不同，Robichaud等［18］使用小鼠品系为 C57/BL6，而既往研究的小鼠为 BALB/c;当时未检测mCLCA5也是一个重要的原因。该文显示虽然RNAi敲除hCLCA1基因表达不能改变MUC5AC的RNA产物，但是对照组 hCLCA1过度表达却使得MUC5AC大量增生，一种可能的解释是hCLCA1是黏液分泌的一种共启动因素或者信号通路，一旦黏液信号瀑布被激发，则反馈性地抑制hCLCA1的活动。

Mundhenk等［2］通过mCLCA3转染人类胚胎肾脏293细胞证明110 kD的mCLCA3前体产生75 kD的氨基端和35 kD的羧基端蛋白质，并以可溶性糖蛋白的囊泡形式分泌出胞而不是在细胞膜上出现。这个结果提示2种mCLCA3的分裂产物可能没有形成阴离子通道，而是作为细胞外的信号分子而起作用，这也证明了Robichaud等［18］的假设。另外Gibson等［22］也认为hCLCA1和mCLCA3是作为细胞间的信号分子而不是作为离子通道起作用。

Petel等［10］使用2种品系的小鼠杂交，其中C57BL/6J近交系小鼠产生黏液过度分泌和气道高反应性，BALB/cJ小鼠则近期产生相同的反应，长期则没有这种作用，分析F2代中只出现上述一种表现的小鼠发现mCLCA3能诱导黏液细胞化生而对气道高反应性没有作用。进一步研究利用生物信息分析钙激活氯通道的基因座时发现mCLCA5在mCLCA3－/－小鼠中也能促使气道杯状细胞化生，mCLCA5在mCLCA3缺失的情况下起到了代偿作用。

总之，钙激活氯通道家族作为一种重要的蛋白，与哮喘杯状细胞增生和黏液过度分泌状态明确相关，起着起始和调控黏液分泌和气道炎症的作用，它能通过上调MUC5AC的基因而促使杯状细胞增生和黏液过度分泌，调节该家族的方式是通过Th2细胞分泌的细胞因子起作用。进一步研究钙激活氯通道的结构和功能，能为治疗干预哮喘高黏液分泌状态提供新的靶点。

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