刺芹侧耳原生质体酶解条件的优化

李艳丽，金周雨，李 玉*

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118)

刺芹侧耳原生质体酶解条件的优化

李艳丽1，金周雨1，李 玉2,*

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118)

以刺芹侧耳菌丝为底物，利用溶壁酶进行原生质体制备，考察酶解因素对原生质体制备的影响。采用单因素试验和正交试验确定最佳酶解条件。结果表明：溶壁酶的最适酶解条件为最适酶解温度30℃、pH6.0、底物质量浓度133mg/mL、酶质量分数1.0%、酶解时间2.5h，在此条件下，刺芹侧耳原生质体的产量为6.34× 107个/mL。

溶壁酶；刺芹侧耳；原生质体；酶解条件；正交试验

刺芹侧耳学名为Pleurotus eryngii(DC.:Fr.) Qu è l.[1]，隶属于真菌门、担子菌亚门、伞菌目、侧耳科、侧耳属，中文名称为刺芹侧耳[2]。它是符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)界定的标准的18种珍稀食用菌之一，是高蛋白低脂肪的绿色食品[3]，此外，刺芹侧耳多糖还具有提高免疫力等众多药理活性[4]。

为更好地开发利用这一珍稀食药用菌资源，众多的研究者展开了刺芹侧耳高产栽培技术的研究，而对其优良新菌株的选育工作报道甚少。与其他技术相比，原生质体技术可以实现菌株的远缘融合、基因转化[5-10]和定向诱变[11-13]，产生更丰富的遗传变异，因此渐已成为遗传改良的重要工具。

作为原生质体技术的重要前提，如何高效地制备原生质体已成为研究者们共同关注的课题之一。本研究通过单因素试验以及正交试验系统地研究酶解因素对刺芹侧耳原生质体制备的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺芹侧耳菌株HB 吉林省食用菌业高新技术园区；溶壁酶 广东省微生物研究所。

甘露醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1(均为国产分析纯)。

1.2 仪器与设备

LEICA-DM1000显微镜 德国徕卡仪器公司；净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司；HZQ-C 空气振荡浴 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DK-420S三用恒温水箱 上海精宏实验设备有限公司；YXQLS-18S1不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 PDA固体培养基配制

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。121℃，高压灭菌30min，冷却备用。

1.3.2 PDP综合培养基配制

马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，VB110mg，水1000mL。121℃，高压灭菌30min，冷却备用。

1.3.3 酶液的配制

精确称取溶壁酶制剂，溶于含有0.6mol/L甘露醇的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，4000r/min离心10min，0.22μm无菌滤膜过滤，备用。

1.3.4 菌丝培养及收集

无菌条件下取固体培养基中培养的菌丝块于液体培养基中，于25℃、100r/min摇床上避光培养5～6d，收集菌丝体，减压抽滤，分别用无菌水和0.6mol/L无菌甘露醇清洗2次，备用。

1.3.5 原生质体的制备与纯化

参考于彦春等[14]的方法，略有改动。

1.3.6 最适酶解条件初步确定的单因素试验

设置温度为20、25、30、35℃，在pH5.5、酶质量分数0.5%、底物质量浓度100mg/mL条件下，水解1.0h，进行原生质体制备，初步筛选最适温度。然后，按此温度进行最适pH值初步筛选实验，分别设置pH值为4.0、5.0、6.0、7.0，其他条件同上。以此类推，按初步筛选的最适温度和pH值进行最适底物质量浓度的初步筛选，设置底物质量浓度分别为33、66、133、200mg/mL。同理设置酶质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，初步确定最适酶质量分数。

1.3.7 酶解条件的优化

根据单因素试验结果，对温度、p H值、底物质量浓度、酶质量分数4个酶解因素拟采用L9(34)进行正交试验(表1)。

表1 酶解条件优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3.8 酶解时间对原生质体制备的影响

根据正交试验所得酶解条件，分别设置酶解时间为1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，考察其对刺芹侧耳原生质体产量的影响，以确定最佳酶解时间。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对原生质体制备的影响

图1 温度对原生质体制备的影响Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on protoplast yield

如图1所示，随着水解温度的升高，原生质体个数迅速升高，达到30℃时，原生质体个数最多，产量最大。之后再随温度升高，原生质体个数随之迅速下降。像所有的酶促反应一样，温度是影响酶活性的重要因素之一。温度升高，溶壁酶活性也随之升高。但酶是生物催化剂，在最适温度之后，随着温度的再升高酶逐渐变性失活，活性反而下降，原生质体个数因此降低。

2.1.2 pH值对原生质体制备的影响

图2 pH值对原生质体制备的影响Fig.2 Effect of pH on protoplast yield

由图2可知，当水解液pH6.0时，原生质体产量最大。在其左右两侧，原生质个数均不同程度下降。由此可见，pH值对原生质体产量影响很大，pH6.0为其最适pH值。这是因为在pH6.0处，酶和菌丝细胞壁物质均处于最佳解离状态，最有利于酶发挥去壁活性，因此原生质体产量最高。

2.1.3 底物质量浓度对原生质体制备的影响

底物质量浓度对原生质体制备的影响表现出3种状态，如图3所示，底物质量浓度由33mg/mL增大至66mg/mL时，反应速度迅速增大。此后，酶解速度随底物质量浓度增加缓慢。当达到133mg/mL以后，原生质体个数增加趋于平稳。

图3 底物质量浓度对原生质体制备的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on protoplast yield

根据酶与底物结合形成中间复合物学说[15]，当底物质量浓度较低时，反应速度与底物质量浓度呈正比。随着底物质量浓度的再增加，底物逐渐被酶饱和，反应速率上升不再明显。当底物质量浓度较大时，底物已被酶饱和，随着底物质量浓度再增加，体系已无多余的酶再与底物结合，因此反应速度不再增加，趋向于最大。

2.1.4 酶质量分数对原生质体制备的影响

图4 酶质量分数对原生质体制备的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on protoplast yield

如图4所示，酶质量分数由0.5%增大至1.0%时，反应速度迅速增大，原生质体产量迅速增加。此后，原生质体个数随酶质量分数增加缓慢。这可能是因为酶逐渐被底物饱和的缘故。

2.2 正交试验结果及分析

对影响原生质体制备的酶解因素温度、pH值、底物质量浓度、酶质量分数进行四因素三水平正交试验，结果如表2所示。对结果的极差分析可以看出，各因素影响的主次顺序为A＞C＞D＞B，最佳配比为A2C3D1B3。正交试验中优选的最佳条件为A2B2C3D1。比较二者，仅B因素不同。由于B因素对制备的影响最小，综合考虑，选取A2B2C3D1为最佳作用条件，即最适温度为30℃、最适pH值为6.0、最适底物质量浓度为133mg/mL、最适酶质量分数为1.0%，水解1.0h，原生质体产量为3.66×107个/mL。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental values of protoplast density in the hydrolysate

2.3 酶解时间对原生质体制备的影响

图5 酶解时间对原生质体制备的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on protoplast yield

如图5所示，在正交试验所得最佳酶解条件下，随着水解时间的延长原生质体产量逐渐增大。当时间为2.5h时，原生质体产量最大，达到6.34×107个/mL。此后，再增加水解时间，原生质体产量反而下降。因此，选取2.5h为最佳酶解时间。

3 讨 论

原生质体的制备方法较多，但酶法最为常用。在酶的选择上，国外通常以Novozyme234酶为主，国内通常以溶壁酶为主进行原生质体制备。Chang等[5]认为在某些菌株原生质体的制备上，溶壁酶的活性优于Novozyme234酶。鉴于溶壁酶较好的酶解效果，且与Novozyme234相比具有价格相对较低的优点，本实验选用溶壁酶作为原生质体制备的酶制剂。

原生质体的制备是一种酶促反应。酶促反应动力学

认为：影响酶促反应速度的因素包括反应温度、p H值、底物质量浓度、酶浓度、激活/抑制剂等[15]。本研究就是从酶促反应动力学出发，较系统地对影响原生质体制备的酶解因素进行研究，确定使酶发挥最大活力的参数条件，从而最大程度地提高原生质体产量。首先进行单因素试验，初步筛选适合的酶解条件。通过单因素试验，原生质体产量由最初的9.60×106个/mL (图1中30℃对应值)提高到1.63×107个/mL(图4中1.5%对应值)。为进一步提高产量，进行正交试验优化酶解条件。正交试验结果显示，原生质体产量由单因素试验的1.63×107个/mL提高到3.66×107个/mL。此后又进行了水解时间的研究。原生质体产量再一次提高，由3.66×107个/mL提高到6.34×107个/mL。由此看出，酶解因素对原生质体制备具有重要影响，进行酶解条件的研究是十分必要的。此外，本实验采用单因素试验和正交试验结合进行系统优化的方法，使原生质的产量得到了显著提高。可见，试验方案的设计是可行的，试验优化是十分必要的。

影响原生质体制备的因素较多，酶解因素无疑是重中之重。但还包括诸如酶的种类、稳渗剂的种类等因素的影响。有很少的文献报道了刺芹侧耳原生质体制备条件的研究[16-17]，虽然报道中包括对酶解条件的研究，但不够全面和充分，且仅限于单因素研究。对酶解条件进行系统优化研究尚未见报道。

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Optimization of Enymolysis Conditions for Preparation of Pleurotus eryngii Protoplasts

LI Yan-li1，JIN Zhou-yu1，LI Yu2,*
(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Engineer Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, Changchun 130118, China)

The optimal conditions for the lywallzyme hydrolysis of the cultured mycelia of Pleurotus eryngii for protoplast production were investigated by single factor and orthogonal array design methods. Results showed that the optimal values of hydrolysis conditions were as follows: substrate concentration 133 mg/mL, enzyme dosage 1.0% and pH 6.0 for a hydrolysis duration of 2.5 h at 30 ℃. The hydrolysate obtained under such conditions exhibited a protoplast density of up to 6.34×107cells/mL.

lywallzyme；Pleurotus eryngii；protoplasts；enzymolysis conditions；orthogonal array design

S646

A

1002-6630(2010)10-0155-04

2009-08-07

李艳丽(1978—)，女，讲师，硕士，研究方向为食药用菌生物化学与分子生物学。E-mail：nongdalyl@yahoo.com.cn

*通信作者：李玉(1961—)，男，教授，博士，研究方向为菌类作物学、作物生态学及植物病理学。E-mail：yuli966@126.com