杂色曲菌素HPLC检测方法的建立及其在大米污染样品中的运用

谭辉勇，方明英，王衡馨，姚冬生，刘大岭*

(暨南大学微生物技术研究所，广东 广州 510632)

杂色曲菌素HPLC检测方法的建立及其在大米污染样品中的运用

谭辉勇，方明英，王衡馨，姚冬生，刘大岭*

(暨南大学微生物技术研究所，广东 广州 510632)

采用自制杂色曲菌素(VA)标准品，建立大米中杂色曲菌素的高效液相色谱检测方法。大米污染样品经丙酮提取、柱色谱净化，HPLC-紫外检测器进行测定，检测波长288nm。结果表明，VA在100～1250ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，r＞0.999，方法回收率在84.12%～105.12%之间，平均变异系数小于7.5%，最低检测限为50ng/mL。该方法灵敏度较高、稳定性好、成本较低，可以用于粮食中杂色曲菌素的定量检测。

杂色曲菌素；高效液相色谱；柱色谱法；紫外检测器

杂色曲菌素(VA，versicolorin A)又称1,6,8-三羟基-2-羟甲基蒽醌，它是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)及杂色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代谢过程中的重要前体物，其结构含有与AFB1和ST相同的毒性基团——双呋喃环[1-2](图1)。早在20世纪80年代，Wong等[3-5]就对VA的急性毒性和致畸变性做了初步研究，其LD50(小鼠静脉注射)为20mg/kg，致突变剂量(ames test)为800ng/皿，因而杂色曲菌素的毒性不容忽视。目前，国内外对粮食和饲料中黄曲霉毒素和杂色曲霉素的危害相当重视，发展了很多高灵敏的分析检测方法[6-7]，但对杂色曲菌素的污染和检测关注不足，未列为法定的检测内容，相应的H P L C分析检测方法仅见McCormick等少数的报道[8-9]，主要以TLC方法[10-12]为主，该法灵敏度不高，可靠性也不强。本研究通过对寄生曲霉诱变菌株的培养，分离纯化、制备VA的标准品，建立杂色曲菌素的HPLC分析检测方法，并对污染的大米样品进行检测运用，探索适合粮食中VA检测的分析方法。

图1 AFB1、ST和VA化学结构式Fig.1 Chemical structure of AFB1, ST and VA

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

寄生曲霉突变菌ATCC 36537 ATCC公司；寄生曲霉突变菌野生菌GIM3395 中国科学院广东微生物研究所；大米 市购。

丙酮、石油醚、正己烷、甲醇、乙醚、二氯甲烷均为AR级，其中用于高效液相色谱仪的试剂均为色谱纯。培养基所需成分(参照菌种说明)购自广州市环出凯微生物科技有限公司；VA(纯度99.99%)。

UFLC系列半制备型高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器) Shimadiu公司；1100系列质谱仪 Agilent公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；arium 611超纯水系统 Sartorius公司；冷冻干燥仪 Lishin公司。

1.2 方法

1.2.1 VA标准品的制备

1.2.1.1 突变菌株的培养

将寄生曲霉突变菌ATCC 36537接种于MEA液体培养基中，24℃黑暗静止培养5d，然后取适量活化后的菌株接入YES培养基24℃黑暗静止培养约10d左右。

1.2.1.2 VA的提取

收获培养好的菌丝体，100℃灭菌15min，充分捣碎，加入足量的丙酮提取，收集丙酮提取液，5 0℃旋转蒸发仪蒸干，加入250mL 体积分数50%的丙酮溶液溶解，转移到分液漏斗中，用100mL石油醚萃取3次，去掉部分杂质，然后加入100mL正己烷萃取3次，收集正己烷层，5 0℃旋转蒸发仪蒸干，溶于适量甲醇备用。

1.2.1.3 VA的纯化制备

采用半制备型高效液相色谱仪进行纯化。仪器条件：柱子：Shim-pack PRC-ODS(20mm×250mm，15μm)；流动相为甲醇-水；洗脱程序为0～30min由95%的甲醇溶液逐步变化为100%的甲醇；流速：4mL/min；进样量：1mL；检测波长为288nm。

1.2.1.4 VA的LC-MS鉴定

仪器条件：柱子：Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保护柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)；柱温：40℃；质谱条件：ESI离子源；离子极性：阴性；扫描范围：50～500u；雾化气压：40psi；干燥气流速：12.0L/min；干燥气温度：350℃；碰撞能量：自动MS/MS：1.0V；选择反应监测：1.0V；目标质量：350u；化合物稳定性：50%；离子阱驱动水平：100%；扫描1：－60.8V；扫描2：－6.0V；八级杆射频振幅：150.0Vpp；锥型体1：5.0V；锥型体2：60.0V；毛细管出口：－148.7V；毛细管出口补偿：－87.9V；目标：30000；自动质谱/质谱阈值：10000；氮气：99.5%；氦气：99.9995%；MS/MS同时记录总离子流色谱图。

1.2.1.5 紫外特征吸收检测及纯度分析

检测条件：柱子：SHIMADIU ODS-C18(4.6mm× 150mm，5μm)；流动相为10mmol/L醋酸铵-20μmol/L乙酸钠溶液(A)和10mmol/L醋酸铵-20μmol/L乙酸钠甲醇溶液(B)，采用梯度洗脱(洗脱程序设定见表1)；流速：0.3mL/min；进样量10mL；二极管阵列检测器，检测波长为288nm。方法参照文献[13]方法并加以改进。

表1 紫外特征吸收检测梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution program for VA analysis

1.2.2 大米样品中VA的检测

将大米在紫外灯下用无菌双蒸水浸泡1h，然后分装于27个预先灭好菌的培养皿(20g/皿)中，向其中24个培养皿中分别接入1mL 1×106CFU/mL的寄生曲霉突变菌野生菌GIM3395孢子悬液(用Tween-80配制)，另外3个培养皿做为空白对照。28℃，相对湿度80%的条件下避光静止培养2 0 d，第3、5、7、1 0、1 1、1 4、

17、20天分别各取3个皿，按下述方法提取、净化和检测。

1.2.2.1 VA的提取

将20g大米样品粉碎，用足量的丙酮提取，将丙酮提取液通过无水硫酸钠过滤，旋转蒸发仪蒸干，加入50mL体积分数50%的丙酮溶液溶解，转移至分液漏斗中；50mL石油醚萃取3次，丢弃石油醚层；在剩下的丙酮溶液层中，加入50mL正己烷萃取3次，收集正己烷层；将收集好的正己烷层于－20℃冰箱中过夜，过滤[14](可除去少量油脂)，蒸干后溶于4mL甲醇，4℃避光保存备用。

1.2.2.2 VA的净化

采用硅胶吸附柱进行样品净化。分别称量5g(200～300目)硅胶、1g(100～200目)硅胶、4g无水硫酸钠110℃活化2h，冷却至70℃左右后于干燥器中保存备用。在15mm×300mm的层析柱中先加入石油醚10mL，然后加入2g无水硫酸钠，用玻棒轻轻搅动，排出无水硫酸钠层内的气泡。然后在装有5g(200～300目)硅胶吸附剂的烧杯中加入15mL石油醚，用玻棒轻轻搅动，使硅胶悬浮，同时打开层析柱下口活塞，使柱内石油醚缓慢流出，将悬浮的硅胶吸附剂移入柱中。当硅胶吸附剂自然下沉，石油醚液面下降至硅胶吸附剂上方3～4cm时，关闭活塞，加入吸附有待净化样品的100～200目硅胶1g (干法上样)，再加入无水硫酸钠2g，然后依次按照下列溶剂洗脱：石油醚10mL，乙醚-正己烷(4:6，V/V)10mL，二氯甲烷-丙酮(9:1，V/V)20mL，收集第3步洗脱剂，旋转蒸发仪蒸干，溶于1 mL甲醇，待测。

1.2.2.3 VA的检测

检测条件同标品制备中的纯度分析。

1.2.2.4 方法的回收率、精密度、线性范围和检出限

向未检出VA的大米空白样品中加入杂色曲菌素标准溶液测定回收率；重复9次计算精密度[15]；通过测定不同质量浓度的杂色曲菌素标准溶液(1 0 0、2 0 0、500、750、1000、1250ng/mL)确定线性范围；信噪比按RSN＞3计[16]，可得杂色曲菌素的检出限。

2 结果与分析

2.1 VA标准品的制备与纯化

图2 VA标准品的制备分离图谱Fig.2 Semi-preparative HPLC chromatogram for VA purification

通过半制备高效液相色谱对粗样品进行分离(图2)，收集保留时间为30.551min的目的峰，不断重复累积，最后冷冻干燥，采用精度为0.001mg的电子天平称量，获得了大约0.6mg VA标准品。

2.2 LC-MS鉴定

图3 VA标准品的一级离子质谱图Fig.3 Mass spectrum of the VA prepared in our laboratory

从质谱图(图3)来看，本实验室制备的VA标准品相对分子质量为338，质荷比(m/z)为337，并且未见其他杂质峰，与国外Hamasaki等[17]报道的结果一致。

2.3 VA标准品的纯度分析及紫外特征吸收检测

用分析型高效液相色谱分析上述的VA标准品，检测表明无其他杂质峰出现(图4)，目的峰纯度达到99.99%，并且其在波长288nm处有明显的紫外特征吸收(图5)。

图4 VA标准品的色谱纯度分析Fig.4 Analytical HPLC chromatogram of the VA prepared in our laboratory

图5 VA标准品的紫外特征吸收图谱Fig.5 UV absorption spectrum of the VA prepared in our laboratory

2.4 标准曲线的制作

在测定的质量浓度范围(100～1250ng/mL)内，VA的质量浓度与峰面积具有较好的线性关系，经计算得到其线性回归方程为y = 0.0212x+13.477，相关系数R=0.99932。工作曲线见图6。

图6 VA的定量标准曲线Fig.6 Standard curve of VA

2.5 回收率、精密度和检测限

在已知不含VA的20g大米对照品中，分别加入600、800、1100ng标准品，每个剂量设3个平行，按1.2.2节中的方法提取，净化和测定VA的含量，计算回收率及变异系数，结果见表2。由表可知，平均回收率为94.59%，平均变异系数为7.45%。该方法检测VA的最低检测限为50ng/mL(RSN＞3)。

表2 方法回收率和精密度测定Table 2 Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels

2.6 大米污染样品的检测

图7 大米污染样品(培养7d)的检测图谱Fig.7 Analytical HPLC chromatogram of rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 (cultivated for 7 days)

用上述HPLC方法对被寄生曲霉污染的大米样品进行检测，VA均能很好的在23.2min左右出峰，其分析图谱见图7。

检测发现，被寄生曲霉污染的大米在培养的第3天即可检出VA，在24个样品皿中，阳性检出率100%，对照组未检出VA(表3)。

表3 VA在大米污染样品中不同培养时间段的检测结果Table 3 Results of determination of VA in rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 at different cultivation time points

3 结 论

本实验通过半制备高效液相色谱分离，纯化和LCM S鉴定，制备了V A标准品，该方法简便、快捷，不需要烦琐的样品前处理过程，并且制备的标准品纯度较高，足以满足一般的研究需求。另外，采用自装硅胶柱成功地对污染了寄生曲霉的大米样品进行净化，并且保持了较高的回收率、达到良好的净化效果。整个方法具有良好的重现性，检测限为50ng/mL，平均回收率达到94.59%，同TLC法相比较，更加灵敏、可靠。由于VA是黄曲霉毒素和杂色曲霉素的重要前体物，VA

的高量检出可能会意味着黄曲霉毒素或杂色曲霉素(依污染菌种而不同)污染的潜在危险。在实际样品中的VA污染情况的调查研究正在进行之中。

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HPLC Determination of Versicolorin A in Aspergillus parasiticus Contaminated Rice

TAN Hui-yong，FANG Ming-ying，WANG Heng-xin，YAO Dong-sheng，LIU Da-ling*
(Institute of Microbial Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

A HPLC method was established for the determination of versicolorin A (VA) in Aspergillus parasiticus contaminated rice using the VA prepared in our laboratory as a

tandard, which was prepared from the fermented mycelia of Aspergillus parasiticus ATCC 36537 through organic solvent extraction followed by semi-preparative HPLC purification. Samples (like rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM 3395 in this study) were extracted with acetone, cleaned up on a silica column and analyzed using a HPLC system equipped with a UV detector at 288 nm wavelength. Results showed that the standard curve of VA exhibited good linearity over the concentration range of 100 to 1250 ng/mL with more than 0.999 correlation coefficient. Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels were between 84.12% and 105.12% with an average relative standard deviation of less than 7.5%. The limit of detection was 50 ng/mL. This method proved to be sensitive, stable and economical and thus is most suitable for the quantification of VA in cereal grains.

versicolorin A；high performance liquid chromatography (HPLC)；column chromatography；UV detector

TS207.3；O657.72

A

1002-6630(2009)10-0254-05

2009- 11-18

谭辉勇(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为分子酶学与酶工程。E-mail：tanhuiyong253@163.com

*通信作者：刘大岭(1963—)，女，教授，博士，研究方向为微生物学。E-mail：tldl@jnu.edu.cn