沙门菌毒力基因研究进展*

方艳红,孙 裴,魏建忠,王桂军,李 郁

(安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036)

沙门菌(Salmonella)有2500个以上的血清型,其中许多血清型菌株在人和动物之间交叉感染,且大部分具有很强的致病性,对沙门菌的研究在畜牧业和公共卫生学上均有重要意义。沙门菌之所以能够致病,是因为有许多毒力因子的存在,这些毒力因子包括脂多糖、肠毒素、细胞毒素以及毒力基因等。近年来,随着现代分子生物学技术的不断发展和应用,对沙门菌毒力基因的研究不断深入。沙门菌具有质粒和染色体毒力基因,其中大多数毒力基因由染色体上的毒力岛编码。本文就沙门菌毒力岛、毒力质粒上毒力基因的研究进展做一综述。

1 毒力岛上毒力基因的研究

毒力岛(pathogenicity island)是存在于病原菌染色体上的特定区域,编码与毒力相关的基因。沙门菌的致病性主要表现在两个方面,一是侵入非吞噬细胞及其在细胞内存活的能力,另一方面是在宿主的吞噬细胞中复制的能力。研究结果表明这些致病能力与沙门菌毒力岛密切相关。目前,已发现的沙门菌毒力岛(salmonella pathogenicity island,SPI)大约有十几个[1],即SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5等。

1.1 SPI1上毒力基因的研究

SPI1是全长约为40 kb的DNA片段,位于沙门菌染色体63′处,其上游和下游分别为fhlA和mutS,G+C含量为42%,含有inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic等基因,编码与侵袭力有关Ⅲ型分泌系统的成分,但并非所有基因都与Ⅲ型分泌系统有关。另外,在61′处还有一个单独存在的sopE基因。

Sop蛋白是通过SPI1-Ⅲ型分泌系统转运的,但是SopE和SopB蛋白却由SPI1位点以外的基因编码。sopE基因位于一个隐蔽的前噬菌体上,而sopB基因存在于SPI5毒力岛上。SopE和SopB可转入宿主细胞,但它们可能有不同的作用。SopB有肌醇磷酸酯磷酸酶活性,可引起腹泻症状,但与侵入无关。SopE与宿主细胞的侵入有关,但sopE基因突变菌株侵袭力的不完全丧失,这表明可能还有其它与侵袭力有关的蛋白存在。最近还发现了一个sopE类似物sopE2,它与sopE具有类似的作用[2]。

hilA是SPI1-Ⅲ型分泌系统的中心调节子,这个蛋白质是含有属于OmpR/ToxR家族DNA结合区域的转录激活因子。hilA直接控制inv/spa操纵子的表达,且所有组成部分的产物都是分泌组织起作用所必须的。而hilA的表达直接由3个与araC相似的激活因子(HilC,HilD和RtsA)所控制,hilC,hilD和rtsA存在于hilA的上游。hilC、hilD和rtsA的缺失将导致hilA表达水平的降低[3]。对控制hilA表达负调节系统的研究中,通过双杂交试验,证明hilE与hilD相连,并且表明hilE通过直接抑制hilD的功能来抑制hilA的表达。近来还有研究表明,AT P依赖性ClpXP蛋白酶可以通过控制鞭毛基因的表达来降低HilC、HilD的含量,从而抑制SPI1活化因子的表达,最终抑制巨噬细胞的凋亡[4]。

沙门菌入侵蛋白(Salmonella invasion proteins,Sips)是侵入过程的起始中心。已有研究表明,转移蛋白酶SipB,SipC和SipD可以调节TTSS调节蛋白的传递。其中SipB蛋白的3-8片段是细菌细胞分泌物分泌所必须的,而且,结合在SipB碳末端80-100个氨基酸之间的sic对于确保SipB,SipC在细胞液中的稳定性是非常重要的[5]。近来有研究表明,SipD在细菌接触宿主细胞之前就存在于细菌表面,而SipB,SipC只有在细菌接触宿主细胞之后才出现在细菌表面[6]。

对org、prg基因的研究表明,prgH,-I,-J或-K和orgA基因也存在于SPI-1,而且这些基因的产物可能是入侵分泌组织的重要组成部分。后来确定,orgA DNA序列的一个错误将导致这个区域编码两个小的基因,而不是一个大的开放阅读框。这些基因已被指定为orgA和orgB。此外,orgB的开放阅读框下游已确定并命名为orgC。还有文献表示prgH,-I,-J和-K基因是转录启动子,而不同于下游基因orgA。为了更充分地描述这个入侵操纵,进一步的研究结果表明,prgH,prgI,prgJ,prgK,orgA和orgB基因都是入侵和分泌所必需的,而orgC不是入侵所必需的[7]。

1.2 SPI2上毒力基因的研究

SPI2全长约40 kb,至少含40个基因,两侧是pyykF和valV tRNA基因。SPI2分为两部分,一部分包含4个操纵子(ssa、ssr、ssc、sse),另一部分含有5个ttr基因(即ttrA、B、C和ttrR、S)。据报道,SPI2-Ⅲ型分泌系统在结构和功能上同SPI1-Ⅲ型分泌系统有别,该岛可控制沙门菌在吞噬细胞和上皮细胞内的复制,并使沙门菌逃逸巨噬细胞环氧合酶的杀伤作用[8]。

SPI2上的基因ssrA-ssrB编码一个二元调节系统,这个调节系统包含一个膜约束传感器激酶(SsrA)和一个同源反应调节器(SsrB),且SsrB已被证明是沙门菌毒力基因的重要调节子。使用转录阵列分析SsrB协同调节基因发现,有一个SsrB-高度依赖性基因srfN(ssrB-regulatedfactor N),SsrB能够激活srfN基因,并直接控制srfN基因在细胞内的感染[9]。此外,比较分析沙门菌ssrB基因突变菌株和野生菌株发现,毒力基因sseL(STM2287,Salmonella secreted effector L)也受ssrB的控制[10]。

编码底物蛋白的操纵子sse包括编码转移成分的基因sseB、sseC和sseD以及转移蛋白SseF、SseG等,这些蛋白与耶尔森菌和肠致病性大肠埃希菌的底物蛋白相似。sseA碳末端区域可编码一个具有形成卷曲螺旋结构潜力的12.5 ku的蛋白,SseA不是一个分泌蛋白,而是SPI2依赖性转移蛋白SifA和PipB所必需的。SifA与沙门菌在细胞胞浆内的生存和复制密切相关。另外,SseA直接与SseB和SseD有关,SseA是SseB和SseD的伴侣蛋白[11]。SseB、SseC和SseD是由SPI2-Ⅲ型分泌系统分泌的存在于细菌表面的复合体,用来转移Sse J等效应蛋白,且与SPI2上效应蛋白SspH1和SspH2转移到感染细胞内这一过程相关。SseB蛋白与真核细胞相互作用,SseB可以形成一个丝状体将SPI2-Ⅲ型分泌系统连接到噬菌体膜上,且在感染试验中,在真核细胞片段上可以找到找到SseB蛋白[12]。

存在于SPI2上的基因ssa用来编码T TSS结构成分。研究证明SpiC(SsaB)蛋白能够被转移到哺乳动物细胞内,SpiC还影响内体小泡在哺乳动物细胞和体外试验中的运输。而且,鼠伤寒沙门菌spiC突变体也表明在感染的巨噬细胞内运输液泡能力增强。重要的是,鼠伤寒沙门菌spiC突变体对小鼠的致病力以及在小鼠体内的生存力均大大减弱。进一步研究表明,spiC突变体与分泌基因突变体一样,毒力都降低了,而且SpiC还是SPI2效应蛋白的转运所必需的,SpiC还可以分泌转运蛋白SseB和SseC,但不分泌SseJ[13]。

1.3 其他SPI上毒力基因的研究

SPI3长约17 kb,位于染色体81′处selC tRNA位点下游,含有10个开放阅读框,构成6个转录单位。这些转录单元包含mgtCB操纵子,编码高亲和力Mg2+传输蛋白质和MgtC。其中mgtCBR基因的产物可介导细菌在巨噬细胞和低Mg2+环境中存活。

SPI4长约25 kb,位于沙门菌染色体下游92′处,其两侧为ssb(编码单股DNA结合蛋白)和sox-SR(编码过氧化物反应调节蛋白),含有18个开放阅读框。编码介导毒素分泌Ⅲ型分泌系统,并参与调节细菌适应巨噬细胞内环境。

SPI5长约7 kb,位于都柏林沙门菌染色体25′处,其两侧为serT和copS/copR位点,G+C含量为43.6%,含有sop、sig、pip基因,编码参与肠黏膜液体分泌和炎症反应的相关蛋白。

SPI6长约59 kb,编码safA 2D和tcsA 2R,引导伴侣蛋白调控菌毛操纵子;SPI7长约134 kb,编码Vi生物合成基因、sopE原噬菌体和ⅣB型菌毛操纵子;SPI8长约6.8 kb,与pheVtRNA基因相连,编码2种细菌素的伪基因(sty3280和sty3282)及整合酶的基因;SPI9长约16 kb,与SPI4相似,编码Ⅰ型分泌系统和独立的Rtx2样蛋白(Sty2875);SPI10长约32.8 kb,存在于基因组的tRNA leuX上,含有sefC、sefR和sefB基因,编码噬菌体和sefA 2R引导伴侣蛋白菌毛操纵子。

除上述这些较大的毒力岛外,还有很多较小的基因插入区域以及与致病性有关的基因。

2 毒力质粒spv的研究

以往的研究的认为,在能够引起严重全身感染的非伤寒沙门菌血清型中,普遍存在一大小约50-90kb的质粒,该质粒与沙门菌的毒力密切相关,因此称其为沙门菌毒力质粒—spv(Salmonella Plasmid Virulence)。但在国内,近来黄瑞等[14]的研究表明,伤寒沙门菌的某些耐药质粒上也含有spv。

研究表明不同血清型的沙门菌都含有一个约7.8 kb的与毒力相关的区域,即spv。spv基因含有spvR、spvA、spvB、spvC和spvD五个开放阅读框,位于这五个基因之后还有一个功能尚未完全清楚的orfE。目前已知spvR编码LysR/metR家族转录活化因子的细菌调节性蛋白,并使基因按照合成SpvABCD的方向进行转录。spvB编码一大小为65 ku的单链多肽,spvA、spvC、spvD分别编码大小为28.2 ku、28 ku、24.8 ku的蛋白质。spv基因编码的产物和细菌的毒力表型关系最为密切。已有实验研究表明,spv基因确实增加沙门菌在肠外组织细胞内的生长,并与细菌血清抗性、粘附与定居有关。近来研究发现,spv基因为细菌在巨噬细胞内存活和生长繁殖所必需的,毒力表现为细胞毒性,细菌增殖可致巨噬细胞分化和凋亡。

[1] Saroj S D,Shashidhar R,Karani M,et al.Distribution of Salmonella pathogenicity island(SPI)-8 and SPI-10 among different serotypes of Salmonella[J].Journal of Medical Microbiology,2008,57:95-102.

[2] Hapfelmeier S,Ehrbar K,Stecher B.Role of the Salmonella pathogenicity island 1 effector proteins SipA,SopB,SopE,and SopE2 in Salmonella enterica subspecies 1 serovar Typhimurium colitis in Streptomy cin-pretreated mice[J].Infect Immun,2004,72(2):795-809.

[3] Ellermeier C D,Ellermeier J R,Slauch J M.HilD,HilC and RtsA constitute a feed forward loop that controls expression of the SPI1 type three secretion system regulator hilA in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Mol Microbiol,2005,57:691-705.

[4] Kage H,Takay a A,Ohya M,et al.Coordinated regulation of expression of Salmonella pathogenicity island 1 and Flagellar T ypeⅢSecretion Systems by A TP-Dependent ClpXP Protease[J].J Bacteriol,2008,190(7):2470-2478.

[5] Kim B H,Kim H G,Kim J S,et al.Analysis of functional domains present in the N-terminus of the SipB protein[J].Microbiology,2007,153(9):2998-3008.

[6] María L T,Jorge E G.Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenicity island1-encoded TypeⅢsecretion system translocases mediate intimate attachment to nonphagocytic cells[J].Infect Immun,2009,77(7):2635-2642.

[7] Joanna R K,Thomas F F,Bradley D J.Transcriptional organization and function of invasion genes within Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenicity island 1,Including the prgH,prgI,prgJ,prgK,orgA,orgB and orgC Genes[J].Infect Immun,2000,68(6):3368-3376.

[8] Uchiya K,Nikai T.Salmonella entericaserovar Typhimurium infection induces cyclooxygenase 2 expression in macrophages:Involvement of Salmonella pathogenicity island 2[J].Infect Immun,2004,72(12):6860-6869.

[9] Suzanne E O,Don Walthers,Ana M T,et al.Pathogenic adaptation of intracellular bacteria by rewiring a cis-regulatory input function[J].Pans,2008,106(10):3982-3987.

[10] Brian K C,Michael J L,Jennifer L B,et al.SseL is a Salmonella-specific translocated effector integrated into the SsrB-controlled Salmonella pathogenicity island 2 TypeⅢsecretion system[J].Infect Immun,2007,75(2):574-580.

[11] Javier R A,Mundy R,Yu X J,et al.SseA is a chaperone for the SseB and SseD translocon components of the Salmonella pathogenicity island 2 encoded typeⅢsecretion system[J].Microbiology,2003,149:1103-1111.

[12] Wilson J W,Coleman C,Nickerson C A.Cloning and transfer of the Salmonella pathogenicityisl and 2 TypeⅢsecretion system for studies of a range of Gram-negative genera[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(18):5911-5918.

[13] Freeman J A,Rapple C,Kuhle V,et al.SpiC is required for translocation of Salmonella pathogenicity island 2 effectors and secretion of translocon protein SseB and SseC[J].J Bacteriol,2002,184(18):4971-4980.

[14] 黄 瑞,吴淑燕,闻玉梅.伤寒杆菌耐药质粒pRs-m介导细菌毒力的研究[J].中华微生物和免疫学杂志,2001,21(3):302-305.