猪脑心肌炎疫苗研究进展

李 宁,李 巍,王金凤,张岭岭,孙继国

(河北农业大学动物科技学院,河北保定071001)

猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起猪的一种急性病毒性传染病,以脑炎、心肌炎和心肌周围炎症为主要特征。该病分布于世界各地,可引起多种动物以及人类感染,危害极大。哺乳仔猪感染后,可发生急性致死性心肌炎,引起同窝和同圈的猪只感染,病死率高达100%。妊娠母猪感染后出现繁殖障碍,表现为流产,产死胎、弱胎、木乃伊胎等症状[1-2]。其它成年猪多呈隐性感染状态,给养猪业造成了极大的损失。猪脑心肌炎主要是猪和某些啮齿类动物的病毒性传染病。家畜中以猪的感染最为严重,人及其他动物也可感染发病。

当前,猪脑心肌炎在世界多个国家均有流行,经济损失严重。1945年首次从美国的佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内分离到脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)。1960年,Murnane等人在巴拿马从具有临床症状的病猪体内检测到了EMCV,首次证实了该病毒对猪的感染性,之后该病在美国、意大利、澳大利亚、韩国等地也不断被报道[3-4]。我国也于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到了EMCV,表明我国有猪脑心肌炎的存在。因此,开展对脑心肌炎的诊断与防制研究,不仅对防治猪脑心肌炎具有必要性,而且具有重要的公共卫生意义。目前,控制猪脑心肌炎最重要的手段依然是接种疫苗,国内对该病尚无有效疫苗可预防,国外已有相应的疫苗研制成功。因此,加强新型疫苗的研制具有重要的意义。现将猪脑心肌炎疫苗的研究进展介绍如下:

1 灭活疫苗

灭活疫苗是技术上最易实现且体液免疫效果较好的一种疫苗,也是目前应用最为广泛的疫苗之一。灭活疫苗使受种者产生以体液免疫为主的免疫反应,它产生的抗体有中和、清除病原微生物及其产生的毒素作用,对细胞外感染的病原微生物有较好的保护效果。Gomez等用了近5年的时间研制出猪用EMCV灭活疫苗,该疫苗安全、有效。最近,McLelland等在北非髯羊、印度羚、岩灰袋鼠和黑猩猩上评价了灭活疫苗的效果,在首免后1个月,所有免疫动物均能产生较高水平的中和抗体,且持续达6个月二免后抗体水平持续升高,在12个月之后仍有较高的抗体水平[5]。以上研究证明灭活疫苗是便于推广使用预防的首选疫苗。但灭活疫苗也有缺陷,如效率低而且保护期较短等,加强免疫佐剂、免疫程序等的相辅相承作用,能有效改善灭活疫苗保护效果。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗既可以产生体液免疫又能产生细胞免疫,但是弱毒疫苗仅适用于少数病原和免疫力低下的动物。并且弱毒疫苗存在着毒力返强的可能。目前有关EMCV弱毒疫苗的报道相对较少,Bogaers W J C等[6]研究了弱毒疫苗的免疫效果,通过腹腔注射和豁膜免疫两种途径免疫小鼠,发现免疫剂量与产生抗体的滴度呈线性相关。攻毒保护试验显示,豁膜免疫产生的保护率比腹腔免疫的保护率要高,提示豁膜免疫对于抗感染具有重要意义。虽然弱毒疫苗可为机体免疫系统提供较好的保护力,但是传统的弱毒疫苗存在毒力恢复的问题,具有一定的安全隐患。

3 活载体疫苗

由于活载体疫苗所表达的外源基因在机体内随载体(病毒)的复制而表达,所以活载体疫苗具有与普通弱毒疫苗相似的优点。与灭活疫苗相比,它用量少,接种方法简单,不需要佐剂添加,从而大大降低了成本,而且免疫保护持续期长,免疫效果好。经典的活载体是致弱的细菌或病毒,除诱导抗其自身免疫应答外,还可作为载体表达其它病原体的免疫抗原。关于EMCV活载体的疫苗研究并不多。Choi B K等[7]EMC-D毒株的VPi基因克隆至牛结核分支杆菌中构建重组活载体疫苗rBCG-VP1,在抵抗腹泻型EMC-D的小鼠攻毒保护试验中,达到100%的保护率。EMCV与FMDV同属于微RNA病毒科的成员,在病毒基因组结构上高度相似。FMDV基因工程疫苗的研究成果对于开展EMCV新型基因工程疫苗研究具有很好的借鉴作用。

4 亚单位疫苗

目前,科学家们正在研究同时针对不同病原的同时具有免疫原型和保护原性的疫苗。在生物科学领域有很多的抗原分子经纯化后可以在动物模型上,甚至是自然宿主中引起免疫保护作用。亚单位疫苗只含有病原体的一种或几种抗原,而不含有病原体的其他遗传信息,因亚单位疫苗具有安全性好、稳定性强和无需灭活的优点而倍受研究者的青睐。Jun H S等[8]克隆了EMCV的VP1基因,并插入到PRSET表达载体上,实现了VP1蛋白在大肠埃希菌中的高效表达。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,并用致糖尿病的EMCV-D株做攻毒保护试验,结果发现试验组达到100%的保护率。由此可见,亚单位疫苗在的预防中具有较好作用。

5 核酸疫苗

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。目前,EMCV核酸疫苗的研究仅限于动物试验阶段。VP1蛋白是EMCV的主要抗原之一,可刺激机体产生中和抗体,也是核酸疫苗构建的主要候选基因。Sin J I等[9]用构建表达EMCV-VP1蛋白和细胞因子GM-CSF的真核表达质粒联合免疫小鼠,证实能够刺激小鼠体内有效抗体的产生,攻毒保护率达80%,而单独用PCT-Gs-VP1免疫的小鼠在异源致死性EMCV的攻毒实验中保护率仅为43%。

6 基因缺失苗

随着分子生物学的发展,可以利用基因工程技术进行毒株改造使之成为有效的疫苗。Duke等在研究中发现,将门哥病毒的5'poly-c区段截短后能显著的降低门哥病毒对小鼠的致病力。用这种改造过的病毒制备疫苗免疫小鼠,不仅能够诱导产生较高水平的中和抗体,而且能够保护小鼠免受EMCV强毒的攻击。随后,Osorio等在非啮齿类动物上又对该疫苗的效果作了评价,并与EMCV灭活疫苗进行比较,结果基因缺失疫苗组在拂拂体内诱导产生的中和抗体水平要比灭活疫苗组高,组织病理学检查发现基因缺失疫苗在拂拂、短尾猿和猪体内均不会引起病理性损伤,证明EMCV基因缺失疫苗适合多种动物,并且安全有效。为了进一步研究基因缺失疫苗的免疫效果,Backues G M等[10]将该疫苗应用于髯猴、狐猴、合趾猴等数十种野生动物,免疫后21 d测定中和抗体,结果发现免疫反应呈现多样性,在免疫动物中均未出现临床症状,鉴于试验是在野生动物园内进行,没有进行攻毒保护试验,但从抗体水平上说明该疫苗可在多种野生动物上适用。虽然研究显示该疫苗具有很好的免疫原性,但作为疫苗,其在动物发病后的抗感染作用及对怀孕母畜的安全性等问题还有待进一步解决。

5 小结

通过各国科研人员的不断努力,猪脑心肌炎疫苗的研究已经取得重要的进展,但还存在着以下亟待解决和关注的问题:①如何开发新型疫苗,以应对当前猪脑心肌炎病毒于环境中共存且变异的情势;②如何提高疫苗对猪脑心肌炎病毒的保护能力;③如何使新型疫苗在既重视获得性免疫和天然免疫的情况下,又能很好地避免母源抗体的干扰。随着科学技术的进步,免疫学、分子生物学、微生物学、生物化学和其它一些基础学科的飞速发展,为疫苗的研究指明了新的方向,并且提供了相关的技术条件保证,特别是基因工程学和蛋白质组学以及其它一些新的技术为主体的现代生物技术的发展更是大大促进了新型EMCV疫苗研究的步伐,EMCV新型疫苗设计理念的不断涌现,新型佐剂的加速开发和应用,以及各种现有疫苗研究的进一步深入,开发安全、有效的猪脑心肌炎疫苗将指日可待。

[1] Murnane T G,Craighead J E,Mondragon H,et al.Fatal disease of swine due to encephalomyocarditis virus[J].Science,1960,131:498-499.

[2] Maurice H,Nielen M,Brocchi E,et al.The occurrence of encephalomyocarditis virus(EMCV)in European pigs from 1990 to 2001[J].Epidemiol Infect,2005,133:547-557.

[3] Helwig F C,Schmidt E C H.A filter-passing agent producing interstitial myocarditis in anthropoidapes and small animals[J].Science,1945,102:31-33.

[4] Kissling R E,Vanella J M,Schaeffer M.Recent isolations of encephalomyocarditis virus[J].P roc Soc Exp Biol Med,1956,91:148-152.

[5] McLelland D J,Kirkland P D,Rose K A.Serologic responses of Barbary sheep(Ammotragus lervia)Indian antelope(Antilope cervicapra),wallaroos(Macropus robustus),and chimpanzees(Pantroglodytes)to an inactivated encephalomyocarditis virus[J].Vaccine,2005,36(1):69-73.

[6] Bogaerts W J C,Durvillevander Oord B J.Immunization of mice with live attenuated encephalomyocarditis virus:local immunity and survival[J].Infect Immunity,1973,8(4):528-533.

[7] Choi B K,Cho S H,Bai G H,et al.Prevention of encephalomyocarditis virus-induced diabetes by live recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin in susceptible mice[J].Diabetes,2000,49(9):1459-1467.

[8] J un H S,Yoon S W,Kang Y,et al.Cloning and expression of the VPl major capsid protein of diabetogenic encephalomyocarditis(EMC)virus and prevention of EMC virus induced diabetes by immunization with the recombinant VP 1 protein[J].J Gen Virol,1995,76:2557-2566.

[9] Sin J I,Sung J H,Suh Y S,et al.Protective immunity against heterologous challenge with encephalvmyocarditis virus by VP1 DNA vaccination:effect of coinjection with a g ranulocyte macrophage colony stimulating factor gene[J].Vaccine,1997,15:1827-1833.

[10] Duke G M,Osorio J E,Palinenberg A C.Attenuation of M engo virus through genetic engineering of the 5'noncoding poly(C)tract[J].Nature,1990,343(6257):474-476.