双黄连冻干粉大鼠血清药物成分的初步研究*

郭 洁，宋殿荣，宋红运，王跃飞，徐燕颖，潘桂湘

（1.天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300150；2.天津中医药大学中医药研究院，省部共建教育部方剂重点实验室，天津 300193）

双黄连冻干粉大鼠血清药物成分的初步研究*

郭 洁1，宋殿荣1，宋红运1，王跃飞2，徐燕颖1，潘桂湘2

（1.天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300150；2.天津中医药大学中医药研究院，省部共建教育部方剂重点实验室，天津 300193）

[目的]对双黄连冻干粉进行血清药物化学分析、阐明其体内药效物质基础，为优化处方配伍提供实验依据。[方法]建立双黄连冻干粉高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱，予大鼠尾静脉注射双黄连冻干粉，分别于10min、12 h取血，通过空白血清、含药血清、双黄连冻干粉HPLC指纹图谱比对，分析双黄连冻干粉的血清药物成分。[结果]双黄连冻干粉HPLC指纹图谱中分离得到21个化合物，其中7个为已知化合物分别为：绿原酸、连翘酯苷、黄芩苷、连翘苷、木犀草素、汉黄芩苷和黄芩素；给药后10min大鼠血清样品中检测到17个原形成分；12 h后可检测到黄芩苷、木犀草素和汉黄芩苷及一未知成分。[结论]7个已知成分可能为双黄连冻干粉体内发挥药效的活性成分及主要物质基础；其中黄芩苷、木犀草素和汉黄芩苷，可能对双黄连冻干粉药效作用的维持发挥了作用。

双黄连冻干粉；药效物质基础；高效液相色谱法指纹图谱；血清药物化学

双黄连冻干粉是中国最早研制成功的中药粉针剂，由金银花、黄芩、连翘3味中药组成，具有抗菌、抗病毒、免疫调节等作用，已广泛应用于临床，治疗细菌、病毒等病原体感染引起的疾病疗效确切。然而随着使用范围越来越广，不良反应的报道也逐年增加。因此，本研究从双黄连冻干粉的血清药物成分入手，阐明体内药效物质基础，为优化处方配伍及新药的二次开发提供实验依据。

1 材料仪器与试药

1.1 试药与试剂 双黄连冻干粉（SHL），规格：600 mg/支，购自哈药集团中药二厂，批号为0711010。绿原酸（110753-200413，纯度>98%）、黄芩苷（(110715-200212，纯度>98%）、木犀草素（111520-200205，纯度>98%）、黄芩素（111595－200604，纯度＞98%）对照品购自中国药品生物制品鉴定所；汉黄芩苷对照品（061012，纯度≥99%）购自上海友思生物科技公司；连翘苷、连翘酯苷对照品（纯度>97%）购自天津一方科技有限公司；试剂：乙睛（色谱纯，MERCK公司），甲醇（色谱纯，MERCK公司），甲酸（分析纯，天津市化学试剂二厂），实验用水为超纯水。

1.2 动物 清洁级Wistar雌性大鼠，体质量（250±10）g，购自中国医学科学院动物研究所，动物合格证号 SCXK(京)2005-0013。

1.3 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Agilent色谱工作站）。

2 方法

2.1 双黄连注射液的制备 取SHL（600mg/支）1支，精密加入生理盐水6mL，超声溶解混匀，配成浓度为100 g/L的SHL注射液备用。

2.2 双黄连供试液的制备 称取适量SHL，转移至10mL容量瓶，30%甲醇定容，超声溶解，配制SHL供试溶液备用。

2.3 对照品溶液的制备 称取适量绿原酸、连翘酯苷、黄芩苷、连翘苷、木犀草素、汉黄芩苷及黄芩素对照品，30%甲醇溶解稀释，配成混合对照品溶液。

2.4 空白血清及含药血清样品的制备 6只Wistar大鼠，按378mg/kg经尾静脉给予SHL注射液，另一组予生理盐水1mL/次，给药后10min、12 h取材。乙醚麻醉后，经眼眶静脉取血0.5mL，离心分离含药及空白血清，-80℃冷冻备用。

2.5 空白及含药血清样品的处理 血清置于室温条件下融化，取0.2mL血清，加入50μL 0.1mol/L盐酸，涡旋 1min，加入甲醇乙腈混合液（1∶1）0.8mL，涡旋1min，室温静置20min，14 000 r/min离心10min，取上清液，于40℃水浴，空气吹干。残渣以100μL流动相复溶，涡旋2min，14 000 r/min离心10min，取上清液进样。

2.6 色谱条件 依利特HypersilODS2色谱柱（4.6mm×250mm,5 μm)；流动相 A-乙腈，B-0.1%甲酸，梯度洗脱：0～10min，18%～28%A，10～20min，28%～42%A，20～25min，42%～55%A；流速 1.0mL/min；柱温 25℃；检测波长280 nm；进样量20μL。

3 结果

分别吸取SHL供试液、对照品溶液、含药血清及空白血清供试液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。比较分析确定入血成分。

4 讨论

SHL高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱中有21个共有峰，与对照品比对，7个共有峰得到归属，见表1。其中黄芩苷、连翘苷、绿原酸和木犀草素，具有较好抗菌、抗病毒作用，为中药黄芩、连翘和金银花质量控制标准的代表成分。连翘酯苷、黄芩素和汉黄芩苷亦有良好的抗菌、抗病毒作用。连翘酯苷是迄今为止从连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，为连翘的主要特征性成分，对合胞病毒、腺病毒3型和7型、柯萨奇病毒等病毒，及金黄色葡萄球菌、停乳链球菌等多种细菌具有较好的抑杀作用。因此，在评价连翘及以抗菌为主要功效的制剂质量时以该化合物为评价指标较为合适。黄芩的黄酮类成分是其发挥药理活性的基础，其中黄芩素和汉黄芩苷是抗菌、抗病毒的主要活性成分，也应作为评价SHL质量标准的特征成分。本研究方法对SHL组方中的3味中药金银花、黄芩、连翘的7个药效代表成分可进行同时测定，方法简便、灵敏，可更加准确、全面地反映SHL的药效代表成分。因此，可用于对SHL质量评价的研究。

表1 色谱峰归属、注射SHL后10m in、12 h大鼠血清移行成分及保留时间(m in)Tab.1 Com ponent-herb originsof themain Peak of HPLC Fingerprintand them igrating com ponentsof serum and containing time(m in)

SHL的给药方式为静脉注射，药物成分直接入血，具有速效、高效的特点。给药后10min，血中检测到17个原形成分，为已归属的7个化合物和10个未知化合物。结合药理作用分析，推测绿原酸、木犀草素、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、连翘苷及连翘酯苷7种已归属的化合物可能为SHL体内发挥药效的主要物质基础，而对其余10个化合物的鉴定及药理作用有待进一步研究。

给药后12 h，SHL大多数原形成分已基本消除，血清中仅检测到4个原形成分，分别为黄芩苷、汉黄芩苷、木犀草素和一未知成分，未检测到新的代谢产物。提示这4种成分在体内存留时间相对较长，对SHL体内药效作用的维持可能发挥了重要作用。绿原酸大鼠体内代谢符合静脉注射二室开放模型，120mg/kg给药时生物半衰期26min[1]。按1.25、2.5、5mg/kg予大鼠静脉注射连翘苷，分布半衰期在5～7min，生物半衰期在21～27min[2]。大鼠静脉注射连翘酯苷50mg/kg后，血药浓度迅速下降，体内分布快，主要以消除过程为主，其在大鼠体内的药动学过程符合三室开放模型[3]。黄芩素在体内血液中发现的主要代谢产物为黄芩苷，尾静脉注射黄芩素后，在大鼠体内被迅速代谢成黄芩苷，30min后降至接近定量限的水平并维持8 h[4]。由此推测，给药后12 h未检测到绿原酸、连翘苷、连翘酯苷及黄芩素可能与其体内代谢特点有关。

SHL自1992年被国家中医药管理局指定为全国中医医院急诊科室必备中成药以来，使用范围越来越广，也屡有不良反应的报道。SHL引起的不良反应约99%发生在第一次用药过程中，其中又有约1/2至1/3发生在用药的30min以内[10]。本研究在给药后10min大鼠的血清中检测到绿原酸和黄芩苷，两种化合物既是SHL抗菌抗病毒的有效成分，又是致敏原[11]，因此对黄芩苷、绿原酸等成分应加强其疗效、毒性与剂量关系研究，调整其在粉针剂中的含量，从而达到安全有效的治疗效果，为优化处方配伍及新药的二次开发提供实验依据。

[1]何 心,石春伟,张兰平.双黄连粉针中绿原酸在大白鼠中的药物动力学[J].中国临床药学杂志,1998,7(3):134-136.

[2]Yun-Xia Li,Xue-Hua Jiang,Liang Huang,et al.Determination of phillyrin in rat plasma by high-performance liquid chromatography and itsapplication to pharmacokinetic studies[J].Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,2006 4(1):628-632.

[3]王进东,柴秋彦,张立伟.连翘酯苷在大鼠体内的药代动学研究[J].世界科学技术—中医药现代化,2008,10(4):53-57.

[4]刘 俊,邱利焱,金 一.RP-HPLC测定黄芩素及其代谢产物黄芩苷大鼠血浆浓度[J].中国药学杂志,2007,42(12):929-931.

Study on serum active constituentsof Shuanghuanglian dry cryogen powder in rats

GUO Jie1,SONGDian-rong1*,WANGYue-fei2,etal
（1.Gynecology of the Second HospitalAffiliated to Tianjin University of TCM， Tianjin 300150， China； 2.The TraditionalChinese Medicine Research Centreof Tianjin University of TCM，key LaboratoryofPharmacology of Formulae，Ministry ofEducation，Tianjin 300193，China）

[Objective]To investigate theactive compounds in Shuanghuanglian Powder Injection(SHL)Itwasdetermined by serum pharmacochemistry for illuminating the elemental pharmacodynamic compounds and providing the foundation for optimizing the prescription of SHL.[Methods]Plasmawas obtained from Wistar rats 10min,12 h after intravenous injection of SHL.Based upon the established HPLC fingerprint of SHL,itwas compared with HPLC fingerprints of blank serum,serum containing drug and SHL.The serum active compounds in SHLwere analyzed.[Results]Twenty-one compoundswere separated by HPLC,seven compoundswere confirmed to be the SHL respectively as follow:caffeotannic acid,forsythoside,baicalin,forsythin,luteolin,wogonoside and baicalein;seventeen compoundscontained in SHLwere determined in the ratsserum afterbeing administrated with SHL for10min.Baicalin,luteolin,wogonoside and a unknown compound were determined in the serum after being administrated with SHL for 12 h.[Conclusion]The seven compounds of SHL maybe the main active compounds and the elemental pharmacodynamic compounds of SHL,Baicalin,luteolin,and wogonoside had an importanteffect inmaintaining the curative effectofSHL.

Shuanghuanglian Powder-Injection;elementalpharmacodynamic compound;HPLC fingerprint;serum pharmacochemistry

R284.2

A

1672-1519(2010)02-0160-03

国家科技部中医药行业资助项目（200707011）。

郭 洁（1982-），女，2009级博士研究生，主要研究方向为妊娠期应用中药的安全性研究。

宋殿荣。

2009-10-09）