桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素的测定及方法学考察*

刘韦鋆 ，赵 骏 ，曾 森 ，刘美平

（1.天津中医药大学研究生，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素的测定及方法学考察*

刘韦鋆1，赵 骏2，曾 森2，刘美平2

（1.天津中医药大学研究生，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]为提取纯化后的桑叶总生物碱供试品中的1-脱氧野尻霉素建立测定方法及对方法学进行考察。[方法]1-脱氧野尻霉素供试品的含量测定采用柱前衍生化高效液相色谱法。[结果]制桑叶总生物碱供试品3份，经测定，供试品中1-脱氧野尻霉素的含量分别为7.99%，8.64%，7.09%。[结论]检测方法简单、快速、准确。

桑叶；1-脱氧野尻霉素；柱前衍生化

桑叶，又名“铁扇子”，始载于《神农本草经》。味苦、甘，性寒，归肺、肝经。具有“疏散风热，清肺润燥，清肝明目”等功效，用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花[1]。有关桑叶降糖活性的机制研究认为与桑叶中的多羟基生物碱的α-糖苷酶抑制作用有密切关系[2]。本研究主要对桑叶总生物碱供试品中的1-脱氧野尻霉素进行测定，考察其方法学的可行性，为提取纯化工艺优化的研究提供监控手段。

1 试剂、药材、仪器

芴甲氧羰酰氯（吉尔生化上海有限公司）；1-脱氧野尻霉素对照品（中新药业）；大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；阳离子交换树脂（天津市海光化工有限公司）；乙腈，甲醇（色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司）；其余试剂均为分析纯；试验用水均为蒸馏水。桑叶药材（购于天津市药材公司）。RE-52AA型旋转蒸发器；Waters-515型高效液相色谱仪；KDM型调温电热套；可剪裁型薄层层析板（天津思利达色谱技术开发公司）。

2 方法及结果

2.1 桑叶总生物碱中的1-脱氧野尻霉素的薄层鉴别 取2mg按2.3制得的供试品，加1mL甲醇溶解。取1mgL-脱氧野尻霉素对照品,加1mL甲醇溶解。分别吸取3μL供试品溶液和对照品溶液，点于薄层板上，展开剂为乙酸乙酯-无水乙醇（2∶8），展开，取出，吹干，碘熏法进行显色，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.2 桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素的含量测定根据文献报道[3]，1-脱氧野尻霉素的含量测定可采用柱前衍生化高效液相色谱法。

2.2.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（PhenomsilC18，250mm×4.6mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.1%冰醋酸（11∶16），检测波长：254 nm，流速：1.0mL/min，柱温：25℃。

2.2.2 对照品溶液的配制 精密称定1-脱氧野尻霉素对照品5mg，置10mL容量瓶中，加0.05mol/L盐酸稀释至刻度,配成浓度为0.5 g/L的1-脱氧野尻霉素对照品溶液。

2.2.3 桑叶总生物碱供试品的配制 取桑叶药材，加蒸馏水煎煮，过滤，滤液通过大孔吸附树脂，收集穿透部分液体，减压浓缩，通过阳离子交换树脂，蒸馏水洗后，用0.5mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得桑叶总生物碱供试品。精密称定桑叶总生物碱供试品30mg，加0.05mol/L盐酸定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液。

2.2.4 1-脱氧野尻霉素的衍生化及测定 分别各取对照品和供试品溶液35μL，加入169μL 0.4mol/L硼酸钾缓冲液（pH=8.5），加入250μL 5mmol/L芴甲氧羰酰氯，混匀，25℃水浴 20 min，加入 25μL 1mol/L甘氨酸、66μL 1%醋酸和162μL蒸馏水，混匀，滤过，测定峰面积。

2.2.5 1-脱氧野尻霉素（DNJ）标准曲线的制备 精密吸取1-脱氧野尻霉素标准对照品溶液分别加盐酸配制成浓度为 0.04、0.08、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40g/L的对照品溶液。按照2.4的方法进行衍生化反应，得峰面积分别为 333 314，595 354，743 158，1406385，1 655 477，1 953 116。以峰面积（Y）为纵坐标，1－脱氧野尻霉素对照品溶液浓度（X）为横坐标作图，得回归方程：Y＝6 208 109.45X＋109 387.72，线性范围为：0.04-0.40 g/L，相关系数 r=0.999 4。

2.2.6 精密度实验 取同一供试品衍生化后的反应液，连续进样5次，测得峰面积的相对平均标准差（RSD）＝0.5%（n＝5），结果表明，本实验所用仪器精密度良好。

2.2.7 重复性实验 在2.1色谱条件下，按2.3方法平行制备5份供试品溶液，按照2.4进行衍生化反应，测定其 DNJ含量，RSD＝2.5%（n＝5），结果显示，本方法重复性良好。

2.2.8 稳定性实验 在2.1色谱条件下，取同一供试品衍生化后的反应液，每隔1 h进样1次，RSD=1.8%（n=5），结果表明，供试品衍生化后在5 h内测定比较稳定。

2.2.9 回收率实验 精密称定供试品6份，分别加入DNJ对照品，在2.1色谱条件下，按照2.4进行衍生化反应，测定其DNJ含量。结果见表1。

表1 回收率的考察（n=6）Tab.1 Exam ination of recovery(n=6)

2.2.10 供试品含量测定 测定供试品峰面积，然后用标准曲线方程计算供试品中1-脱氧野尻霉素的含量，分别为7.99%，8.64%，7.09%。

3 讨论

3.1 生物碱的定性鉴别 由于1-脱氧野尻霉素不易显色，笔者先后尝试了碘化铋钾显色法、硅钨酸显色法、雷氏铵盐显色法等，显色效果均不好。最后采用碘熏法，显色良好。

3.2 衍生化法测定因素的考察

3.2.1 供试品自身干扰情况 将供试品衍生化前后进行比较，衍生化后，可出现目标峰。无衍生化的供试品在254 nm处无吸收。见图1-3、比较后得出供试品本身在此色谱条件下对测定无干扰。

3.2.2 水浴中反应时间的考察 25℃水浴，分别反应 10、20、30、40min，峰面积为 1198 892，1 349 802，1 297 403，1 315 728。可见水浴中反应20min，峰面积最大。故确定，水浴反应时间为20min最佳。

3.2.3 水浴温度的考察 分别在20、25、30、35℃水浴中反应20min，峰面积为1 349 802，1 423 646，1 251 938，1 161 261。可见25℃时，峰面积最大。故确定，水浴温度为25℃最佳。

3.2.4 缓冲剂pH的影响 在衍生化反应过程中，同一供试品加入pH值分别为7.99，8.19，8.50，8.61，8.78 的缓冲剂，峰面积为 496 454，527 976，543 934，542 169，539 723。可见缓冲剂pH值为8.5时，峰面积最大。故确定，缓冲剂pH值为8.5时最佳。

4 结论

制备桑叶总生物碱供试品3份，经测定，1-脱氧野尻霉素的含量分别为7.99%，8.64%，7.09%。本检测方法简单、快速、准确。为桑叶有效组分的制备做准备，并给桑叶的综合利用及糖尿病的预防和治疗药物的开发研究奠定了一定的基础。

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005：209-209.

[2]李 宏，黄金山，胡 浩，等.桑叶对葡萄糖苷酶活力的影响及降糖机理的研究[J].中国蚕业，2003，24(2)：19.

[3]施新琴，崔为正，裘立群，等.反相高效液相色谱-紫外检测法测定家蚕和桑叶中1-脱氧野民霉素的含量[J].全国桑树种质资源及育种和蚕桑综合利用学术研讨会，2005：44-51.

Study on the Measurementand Methodology of 1-deoxynojirim ycin in TotalA lkaloids from Mulberry Leaf

LIUWei-jun,ZHAO Jun,ZENGSen,etal
（Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

[Objective]To extractand purify 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafand to establish themethod of contentdetermination.[Methods]The 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafwasmeasured by using pre-column derivation high performance liquid chromatography.[Results]In thisway，the purity was exceeded above 7.99%，8.64%，7.09%.[Conclusion]Thismethod wassimple，high-speed,and accurate.

mulberry leaf;1-deoxynojirimycin in totalalkaloids;pre-column derivation

R917

A

1672-1519(2010)02-0166-03

高等学校科技创新工程重大项目培育基金项目资助课题（706013）。

刘韦鋆（1982－），男，在读硕士研究生，主要研究方向为中药化学。

赵 骏。

2009-11-21）