枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白产生的最佳发酵条件及温室防效

张秀玉 ，孔凡玉，王 静，张成省，李佰乐 ，杨 斌，管志坤，王秀萍

(1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.山东青岛烟草有限公司，青岛 266071；4.山东青岛烟草有限公司胶南分公司，山东 胶南 266400)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温的好氧性产芽孢杆状细菌(G+)，具有广泛的抗菌活性和极强的抗逆能力，易于商业化，因此一直是植病生物防治领域的研究热点[1-5]，其中一些优良菌株已被应用于生产[6-7]。Bacillus subtilis 在生长代谢中主要产生抗蛋白的最适培养基及培养条件进行了初步探讨。生素和抗菌蛋白等拮抗物质[8-9]。

从烟草根际土壤分离到一株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有较强拮抗作用的生防细菌SH7，经细菌常规及16s rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其无菌发酵液对烟草青枯病的温室盆栽试验防效较好，并初步证明了该菌产生的拮抗物质为蛋白类物质[10]。笔者对SH7菌株拮抗蛋白的最适培养基及培养条件进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

指示菌为烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)，拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SH7菌株，均由中国农业科学院烟草研究所植物病理学实验室分离纯化。

1.2 方法

1.2.1 最佳培养基筛选 拮抗菌SH7菌株最适液体培养基从NA，ATCC，LB，BPY，TYG等[11]中筛选。pH7.0，28 ℃，150 r/min，振荡培养48 h；以菌体生长量，抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性为指标，确定菌株产抗菌蛋白的最佳培养基。每组试验重复3次.

1.2.2 菌体生长量测定 将培养完后的菌体培养液稀释成不同的浓度梯度，吸取100 μL均匀涂布在NA固体培养基上，28 ℃下培养24 h；观察菌体状况和测量菌落数，计算出菌体生长量。每组实验重复3次。

1.2.3 抗菌蛋白粗提取 培养液于8000 r/min离心10 min去菌体，取100 mL上清液，冰浴、搅拌缓慢滴加硫酸铵，直到上清液达到90%的硫酸铵饱和度，4 ℃静置过夜；12000 r/min 4 ℃离心10 min取沉淀，沉淀用0.02 mol/LTris-HCL缓冲液(pH7.2)溶解，置于透析袋(截留相对分子质量3500)中，用同浓度的缓冲液透析去盐即得到抗菌蛋白粗提液，检测抑菌活性。蛋白质的浓度测定按照文献[12]。

1.2.4 抗菌活性测定 采用牛津杯扩散法法。将指示菌烟草青枯病菌悬液加入50 ℃ NA固体培养基中倒平板，将待测的活性物质注入孔内，每个牛津杯注入150 μL，28 ℃下培养24 h，以不接种SH7菌株的相同培养基按1.2.2方法提取蛋白作空白对照，观察抑菌状况并测量抑菌圈大小。

1.2.5 培养条件的优化 以最佳培养基和筛选培养基的培养条件为基础，通过分别改变培养基的初始pH(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、装液量(250 mL三角瓶每瓶装50, 75, 100, 125, 150, 175 mL)、培养温度(22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36 ℃)、培养时间(12, 24, 36, 48,60, 72, 84, 96, 108 h)和摇床转速(130, 150, 170, 190,210, 230 r/min)，按方法1.2.2测菌体生长量，按方法1.2.3 提取抗菌蛋白并检测其浓度，按1.2.4方法检测抑菌活性；以菌体生长量、抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性为指标，来确定该菌种产抗菌蛋白的最佳培养条件。每组试验重复3次。

1.2.6 抗菌蛋白粗提物特性测定 用pH为2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10的邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠-柠檬酸、Tris-CL及硼砂缓冲液代替水，将粗提拮抗蛋白分别调至不同pH；将抗菌蛋白粗液分别于20, 40, 60,80, 100, 121 ℃处理20 min；分别按1.2.3方法检测抑菌活性，每孔加入150 μL的处理液，以未经处理抗菌蛋白粗液作对照，24 h后观察抑菌状况和测量抑菌圈大小。

1.2.7 室内防效测定 待烟草(NC89)株高为20 cm时，设2个处理：1)同时注射抗菌蛋白粗提液和烟草青枯病菌；2)注射烟草青枯病菌为空白对照。在烟草第2片真叶的叶腋处将菌液注射到茎内维管束部位，抗菌蛋白粗提液质量浓度0.10 mg/mL，菌液浓度均为1×108cfu/mL，每株烟草注射0.5 mL，每处理30株烟草。于注射烟草青枯病菌后第30天调查发病情况。

2 结 果

2.1 培养条件对SH7菌株及其抗菌蛋白的影响

2.1.1 培养基种类 不同液体培养基对SH7菌株产抗菌蛋白量及其抑菌活性、菌株生长的影响如表1。NA培养基可产较多抗菌蛋白且活性相对较高，抑菌圈直径达22.4 mm，蛋白质的质量浓度达0.116 mg/mL，同时NA培养基也利于菌体的生长，菌体量为8.0×108cfu /mL，所以NA培养基最适宜于SH7菌株生长和产抑菌蛋白。

表1 培养基对抑菌活性、抗菌蛋白产量及菌体生长的影响Table1 Effects of medium on inhibition ability, antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.2 起始pH 由表2可看出，SH7在中性及碱性环境中生长，能产生抑菌蛋白，而在中性环境对菌体的生长、抗菌蛋白的产生及积累最为有利。在pH6.0时，产生较多的抗菌活性物质，抗菌蛋白相对含量较高，表现的抑菌活性最强，抑菌圈直径为23.1 mm，蛋白质含量为0.162 mg/mL，菌体量为6.3×108cfu /mL，故pH6.0最适。

表2 pH对抑菌活性、抗菌蛋白产量及菌体生长的影响Table2 Effects of different pH on inhibition ability,antagonistic protein of SH7and its growth

2.1.3 装液量 从表3得知，SH7在不同的装液量下均能生长且产生抗菌蛋白，但装液量过多或过少均不利于菌体的生长，从而影响抗菌蛋白的产生。装液量100 mL时菌体生长量、抗菌蛋白含量和抑菌活性最高，菌体量为5.8×109cfu/mL，抑菌圈直径达21.7 mm，蛋白质含量为0.148 mg/mL，装液量100 mL为最适。

表3 装液量对抑菌活性、抗菌蛋白产量及菌体生长的影响Table3 Effects of medium volume on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.4 培养温度 从表4得知，在26 ℃和28 ℃时，菌体生长量和产生蛋白量相差很少，而26 ℃时抑菌活性远远比28 ℃时高，即产生的抑菌活性物质较多，抑菌圈直径达17.6 mm，故最适温度为26 ℃。

2.1.5 培养时间 从表5得知，在一定时间范围内，随着培养时间的增加，菌体的增长量与蛋白的产生量呈正比关系。96 h时菌体生长量和蛋白含量达到最大值，分别为：2.3×1011cfu/mL, 0.214 mg/mL。且在96 h时抑菌圈直径最大为21.6 mm，即此时具有活性的抑菌蛋白含量最多，故96 h为最佳培养时间。

表4 培养温度对抑菌活性、抗菌蛋白产量及菌体生长的影响Table4 Influence of culture temperature on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

表5 培养时间对抑菌活性、抗菌蛋白产量及菌体生长的影响Table5 Influence of culture time on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.6 转速 不同转速下，菌体生长的通气量不同，从而影响菌体的生长。从表6可知，在170 r/min时蛋白含量和菌体生长量均达到最大值，分别为：0.159 mg/mL, 8.7×109cfu/mL，此时抑菌圈直径也最大为18.8 mm，故170 r/min为最佳培养转速。

2.2 抗菌蛋白粗提物特性

抑菌蛋白粗提液经20～60 ℃处理20 min后抑菌活性基本保持不变，80 ℃处理20 min后抑菌活性稍微下降，100 ℃和121 ℃处理20 min后分别保持抑菌活性的83.1%和68.0%，说明该抑菌蛋白的热稳定性较好。

常温(28 ℃)下测定得，在pH中性及偏碱性范围内，抗菌蛋白粗提液保持大部分抑菌活性，而在酸性环境中基本没有抑菌活性。pH为2.0, 3.0, 4.0时其抑菌活性接近 0；pH5.0时其抑菌活性仍保持32%；pH6.0和7.0时其抑菌活性仍保持100%；pH8.0,9.0, 10.0时其抑菌活性分别为89%, 86%, 88%，说明该抑菌蛋白的中性及碱稳定性比较好。

2.3 室内防效效果

注射抗菌蛋白粗提液对烟草青枯病能起到较好的防治效果，防效达70.8%，其发病率为29.2%；空白对照发病率为92.10%。

3 讨 论

本实验室分离的SH7是一株枯草芽孢杆菌，实验证实SH7菌株对烟草具有促生作用，对其他作物青枯病菌、烟草黑胫病和烟草赤星病菌具有良好的拮抗作用，且已分离纯化出具有抑菌活性的蛋白，其分子量是33.6 kD(另文报道)。本次实验用充分盐析后的硫酸铵沉淀物进行一系列的温度处理，在20～60 ℃处理 20 min后活性基本保持不变，100℃和121 ℃处理20 min后分别仍保持抑菌活性的83.1%, 68.0%；该抑菌蛋白在pH为9.0, 10.0时其抑菌活性仍分别为86%, 88%，说明对热、碱性条件稳定，可与一些碱性药剂一起施用。从最佳培养时间的筛选中可以看出，在一定时间范围中，随着培养时间的增加，蛋白含量与菌体生长量成正比。

[1]陈中义，张杰，黄大昉.植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J].植物病理学报，2003，33(2):97-103.

[2]陈志谊，高太东，严大富，等.枯草芽孢杆菌 B2916防治水稻纹枯病的田间试验[J].中国生物防治，1997，13(2)：75-78.

[3]Sturz A V, Christie B R, Nowak J.Bacterial endophytes:Potential role in developing sustainable systems of crop production [J].Critical Reviews in Plant Sciences, 2000,19(1): 1-30.

[4]Raupach G S, Kloepper J W.Mixtures of plant growthpromoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens [J].Photopathology, 1998,88(11): 1158-1164.

[5]隋文志，丁丽俐，吴魁斌.枯草芽孢杆菌 HB248防病增产效果研究[J].现代化农业, 1995(3):4-5.

[6]Baker K F.Evolving concepts of biological control of plant pathogens [J].Ann Rev Phytopathol, 1987, 25:67-85.

[7]Asaka O，Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Baccilus subtilis RB14 [J].App1 Environ Microbiol, 1996, 62 (11): 4081-4085

[8]Moyne A-L, Cleveland T E, Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D [J].FEMS Microbiology Letters, 2004, 234: 43-49.

[9]Ahimou F, Jacques P, Deleu M.Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity [J].Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27: 749-754.

[10]王静, 赵廷昌，孔凡玉，等.SH7对烟草青枯病的抑菌、防病作用及其抑菌物质的初步研究[J].中国烟草科学2007，28(2): 41-44.

[11]中国微生物菌种保藏委员会.中国菌种目录[M].北京：轻工业出版社，1983: 404-422.

[12]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.