布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

徐 杰,王玉飞,汪舟佳,乔 凤,钟志军,3,杜昕颖,赵 瑾,曲 勍,高 岚,陈泽良*

(1.兰州大学生命科学学院,甘肃兰州 730000;2.军事医学科学院疾病预防控制所,北京 100071;3.南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095)

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

徐 杰1,2,王玉飞2,汪舟佳2,乔 凤2,钟志军2,3,杜昕颖2,赵 瑾2,曲 勍2,高 岚1*,陈泽良2*

(1.兰州大学生命科学学院,甘肃兰州 730000;2.军事医学科学院疾病预防控制所,北京 100071;3.南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095)

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。

布鲁菌;Omp31蛋白;原核表达;抗原性

布鲁菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁菌(Brucella)侵入机体引起的传染-变态反应性的人畜共患传染病。布病在世界各地都有广泛流行,该病不仅损害人类健康,还影响着乳、肉及其制品、皮毛、医药等在内的民生需求,影响畜牧业发展和百姓致富,乃至国际贸易及旅游事业。而且它引起的人类波浪热、慢性感染以及反刍动物流产和睾丸炎等,至今尚无根治方法[1]。我国人、畜布病波及24个省市、自治区和直辖市。2008年全国共报告人间布病病例28 281例,远远超过历史上发病人数最多的1963年(12 097例)。

人间布病发病率的回升与动物间布病的发病率呈正相关,能反映动物布病的波动,这些数据表明,我国动物布病防治形势非常严重。接种布鲁菌疫苗是预防布病的最有效的手段,而准确的诊断则是有效控制和消灭布病的前提,但目前常用的布病血清学诊断方法不能区分是疫苗免疫还是自然感染后引起的血清学反应。研制具有标记性的疫苗或寻找合适的布鲁菌诊断性抗原具有重要的意义。近年来寻找具有抗原保护作用的布鲁菌诊断抗原一直是人们的目标,所以具有抗原保护作用的布鲁菌外膜蛋白就成了研究的热点。Omp31是OmpA家族成员之一,是布鲁菌的重要外膜蛋白,在维持细菌外膜结构稳定性中发挥着重要作用[2-3]。本研究克隆了羊布鲁菌的Omp31基因,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达,用复性纯化的表达产物进行Western blotting分析。本试验为寻找布病的诊断性蛋白和布鲁菌基因缺失标记苗的研制提供了可供的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒载体 布鲁菌B.melitensis55009购自中国药品生物制品检定所[4-5];大肠埃希菌ER2566(DE3)购自New England Biolabs公司;E.coliDH5α、pET32a质粒为解放军疾病预防控制所传染病控制中心实验室保存和提供。

1.1.2 试剂盒、酶和试剂 PCR产物回收试剂盒、DNA胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自天根公司,各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司;Taq酶和T4DNA连接酶购自NEB公司;DNA Marker、蛋白Marker购自全式金公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 Omp31的PCR扩增及表达载体的构建从GenBank中下载B.melitensis16M 的序列,使用Primer Premier 5软件进行引物设计,其中上游引物Omp31-E-F(AGCTGGATCCGTGGT TGT TTCTGAACC)的5′端添加BamHⅠ酶切位点,下游引物Omp31-E-R(AGCTAAGCTTGAACT TGTAGTTCAGACC)的5′端添加HindⅢ酶切位点。扩增的目的基因为 657 bp,编码 219个氨基酸。提取B.melitensis55009的基因组DNA作为模板,用Omp31-E-F和Omp31-E-R扩增omp31基因。PCR产物纯化后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与同样酶切处理的pET32a连接,连接产物转化DH5α,得到pET32a-Omp31。重组质粒经PCR和酶切鉴定正确后,测序确定序列的正确性。

1.2.2 重组蛋白表达 将鉴定为阳性的pET32a-Omp31转化大肠埃希菌ER2566中,挑取单克隆接入含氨苄青霉素的 LB液体培养基中,用0.5 mmol/L的IPTG诱导,同时设阴性对照,SDSPAGE检测目的蛋白的表达。阳性菌株进行大量诱导,超声裂解破碎后,分别收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE,对融合蛋白进行可溶性分析。

1.2.3 重组蛋白的纯化 用5倍柱体积的细胞裂解液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,pH8.0)平衡Ni-NTA离子亲和交换凝胶柱。将菌体超声破碎后的上清上样,流速控制在1 mL/min以内。上样完毕后,再用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,50 mmol/L imidazole,pH 8.0)进行洗涤;最后用洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,pH 8.0)洗脱目的蛋白,收集洗脱后的样品进行透析去盐和120 g/L的SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 重组蛋白的抗原性检测 用Western blot分析重组蛋白的免疫原性。纯化产物经SDS-PAGE电泳后,通过湿转法转膜至硝酸纤维素膜,用含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭过夜,用TBST漂洗后,用本实验室纯化的兔抗布鲁菌抗体为一抗,同时设正常兔血清作为对照,室温孵育1 h,漂洗后,加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,室温孵育1 h,漂洗后将膜浸入DAB底物溶液中,至目的条带清晰时终止反应。

2 结果

2.1 pET32a-Omp31原核表达载体的构建

扩增的特异目的片段长约657 bp(图1),纯化后的PCR产物后用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,与同样酶切处理的pET32a连接,转化E.coliDH5α感受态细胞。氨苄平板上长出来的克隆,菌落PCR鉴定阳性后,提取质粒,BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,可切出载体带和657 bp的克隆片段(图2)。酶切鉴定阳性克隆进行序列测定,测定结果表明所克隆的序列与GenBank中的羊布鲁菌16 M的Omp31(BMEI0844)基因序列完全相同。

图1 omp31基因PCR扩增结果Fig.1 PCR product of omp31 gene

图2 pET32a-Omp31双酶切鉴定Fig.2 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET32a-Omp31

2.2 重组蛋白的诱导表达

将重组质粒pET32a-Omp31转入表达宿主菌E.c oliER2566(DE3)中,经 IPTG诱导后进行 SDSPAGE电泳分析,同时设诱导前阴性对照,考马斯亮蓝染色。结果表明其表达产物的分子质量在30 ku～50 ku之间,与预测的分子质量43 ku相符(图3)。离心收集少量诱导后的菌体,用去离子水悬浮,超声破碎后,分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,结果表明表达产物主要以包涵体的形式存在(图3)。

图3 含pET32a-omp31表达质粒菌株的诱导表达Fig.3 T he expressed products of recobinant plasmid pET32a-Omp31(ER2566)by IPTG

图4 重组蛋白的纯化Fig.4 The purification of rOmp31 protein

2.3 重组蛋白的纯化

重组蛋白的阳性菌株大量诱导后,离心收集菌体,用PBS悬浮,超声裂解破碎,分别收集上清和沉淀。将上清经Ni-NTA离子交换树脂亲和纯化,并进行SDS-PAGE电泳,显示清晰的目的条带(图4)。

2.4 免疫印迹分析

表达重组蛋白的宿主菌经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,转膜至硝酸纤维素膜,采用本室纯化的兔抗布鲁菌IgG抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体为二抗进行免疫印迹分析。结果表明诱导后在表达重组蛋白的位置上有一条特异的反应条带(图5),说明重组蛋白可与抗布鲁菌抗体发生特异性反应。研究结果表明纯化的重组蛋白具有与相应天然蛋白相同的抗原性。

图5 重组蛋白的Western blot检测Fig.5 The results of Western blot of recombinant protein

3 讨论

布鲁菌病在世界范围内广泛流行,是全球特别是发展中国家面临的非常严重的公共卫生问题,严重影响着人类健康和畜牧业发展。布鲁菌侵入动物的生殖系统,引起母畜的流产、公畜睾丸炎不育和各种组织的损害为特征。人布病常因误诊而转变成慢性,反复发作,长期的多种抗生素治疗却无法根治。人间布病是因直接接触布病病畜、未彻底灭菌病畜污染的奶制品等而感染[6]。控制布病的关键是及时检验和免疫动物,消除动物传染源。一方面,要建立快速而准确的布病诊断方法;另一方面,则要做好疫苗免疫和病畜的淘汰工作。因此,建立疫苗免疫后区分自然感染和疫苗免疫的方法,及时免疫和淘汰变得尤为重要和迫切。基因缺失标记疫苗通过缺失一个或几个布鲁菌保守性的基因,在不影响疫苗免疫保护作用的条件下,可通过检测缺失基因的存在与否达到区别和鉴定的目的,从而能够及时淘汰感染的病畜[7]。Omp31蛋白是OmpA家族的成员,在保持外膜结构完整性、抵御多种杀菌环境中起着重要作用。Omp31是布鲁菌的一个免疫保护性抗原,可用于布鲁菌的鉴定[8]。布鲁菌的Omp31基因缺失株没有改变细菌的生物学特性[9]。因此,大肠埃希菌外源表达的Omp31蛋白作为检测抗原在布病的血清学检测中具有重要意义。本试验扩增布鲁菌外膜蛋白Omp31的基因,并原核表达Omp31蛋白,证明Omp31蛋白具有特异的免疫反应原性,是一种非常好的布鲁菌诊断抗原。同时本试验也为后期的蛋白功能鉴定和基因缺失标记疫苗株的研制奠定了基础。

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Expression and Antigenicity Analysis of the Omp31 Protein ofBrucella melitensis

XU Jie1,2,WANG Yu-fei2,WANG Zhou-jia2,QIAO Feng2,ZHONG Zhi-jun2,3,DU Xin-ying2,ZHAO Jin2,QU Qing2,GAO Lan1,CHEN Ze-liang2

(1.College of Lif e Science,Lanzhou University,Lanzhou,Gansu,730000,China;2.Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Science,Beijing,100071,China;3.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,N anjing,J iangsu,210095,China)

In order to clone and express the Omp31 protein ofB.melitensisinE.coli,purify the expressed protein and detect its immunogenicity.A gene recoding outer membrane protein 31-34 ku(Omp31)was amplified from the genomic DNA ofB.melitensisby PCR.The amplified fragments were digested withBamHⅠandSalⅠ,and then cloned to the vector pET32a.The constructed recombinant plasmid pET32a-Omp31 was transformed toE.coliER2566(DE3)and was induced to express the fusion protein.Then the protein was purified by histidine-binding resin column chromatography,and the immunogenicity was detected by Western blot.The PCR product of Omp31 gene was cloned to the vector pET32a,and the recombinant vector was confirmed by colony PCR identification,recombinant vector digested identification and sequencing analysis.It was successfully expressed inE.coliER2566(DE3)as a fusion protein with histidine at the presence of IPTG,and a specific protein band of 43 ku was found when identified by SDSPAGE.Western blot showed good immunoreactivity of the expressed product.Omp31 was successfully cloned and expressed,and the purified fusion protein had immunogenicity.This study provides a solid foundation for the further study on the function of proteins and brucellosis diagnostic antigens.

Brucella;omp31;prokaryotic expression;antigenicity

S852.614;Q786

A

1007-5038(2010)01-0017-04

2009-08-19

国家自然科学基金项目(30600024);国家＂863＂资助项目(2007AA02Z412)

徐 杰(1983-),男,山东泰安人,硕士研究生,主要从事病原菌基因工程研究 。*通讯作者