猪流感病毒聚合酶PB1蛋白亚细胞定位的研究*

王晓杜,陈培君,沈 阳,马志永

(中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241)

猪流感病毒聚合酶PB1蛋白亚细胞定位的研究*

王晓杜,陈培君,沈 阳,马志永*

(中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241)

猪流感病毒PB1蛋白在其复制中起着转录作用,是病毒复制所必需的蛋白。克隆了猪流感病毒的PB1基因,构建重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂质体转染Vero细胞后,分别用Western blot和IFA检测重组蛋白FLAG-PB1蛋白的表达,结果表明重组蛋白能在真核细胞中得到表达,其亚细胞定位为细胞核表达,与其功能密切相关,为以后流感病毒的相关研究打下了基础。

猪流感病毒;PB1蛋白;亚细胞定位

流感病毒属于正黏病毒科负链RNA病毒,自从1918年发生西班牙大流行以来,在全世界多次出现大流行,2009年发生在墨西哥的甲型H1N1流感病毒,是含有猪源流感病毒的三元重配病毒,已经传播到世界各地,2009年6月12日世界卫生组织把警戒级别提高至6级,预示着流感的再次大流行,感染对象由老人和儿童转向对青壮年的高致病性,在流行病学上的变化,进一步体现了流感病毒的强变异性。研究流感病毒的复制机制,寻找预防和治疗流感的疫苗和药物,是当务之急。流感病毒的复制是3个P蛋白和NP蛋白形成复制酶复合物,相互协同作用发挥RNA的复制作用,同时可以与病毒基因组RNA结合形成RNP,是病毒复制和包装所必需的[1]。单一决定3个聚合酶基因的毒力是非常困难的,但是不同物种来源的病毒聚合酶基因,其物种复制能力有较大差异,这些可能是流感病毒跨物种传播的机制之一。

流感病毒的PB1蛋白由病毒基因组片段2编码,由757个氨基酸组成,具有聚合酶活力的蛋白。病毒的RNA聚合酶是由PB1、PB2、PA蛋白形成的异源三聚体,所有的3个亚基都是病毒复制所必需的[2]。其中PB2亚基能绑定真核细胞的mRNA帽子结构,并剪切下帽子连作为病毒转录所需的引物[3]。PB1蛋白主要执行是聚合酶的功能,合成病毒所需的3种 RNA,即(v)RNA、(c)RNA、mRNA[4]。该蛋白带有两个必需的核定位序列,推测可能定位在核内,发挥其功能[5]。既然PB1蛋白具有复制酶的功能,那么其在抗病毒药物靶标分子的研究中具有重要作用,同时也应该在跨种间传播中发挥重要功能。本研究克隆猪的H3N2亚型流感病毒PB1基因全长CDS区,真核表达PB1蛋白,间接免疫荧光观察PB1蛋白的亚细胞定位,为利用PB1蛋白作为抗病毒药物靶标分子的研究,以及研究流感病毒入侵宿主后的机制等相关工作做了前期研究。

1 材料与方法

1.1 材料

猪流感病毒(Influenza A/Swine/Jiangsu/2/2006/H3N2)、大肠埃希菌 DH5α、Vero 细胞、MDCK细胞、真核表达质粒p3xFLAG-7.1由中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生实验室保存和提供。AMV反转录酶、PCR扩增用Taq酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、T载体试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒抽提和DNA片段回收试剂盒购自博大泰克生物技术公司。DMEM和胎牛血清购于Gibco公司。lipofectamine-2000购于invitrogen公司。羊抗小鼠FLAG抗体购于Sigma公司。H RP标记的羊抗小鼠二抗和FITC标记羊抗小鼠荧光二抗购自Santa Cruz公司。ECL发光试剂盒购于Pierce公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆与真核表达质粒的构建 流感病毒感染MDCK细胞12 h后,提取细胞总RNA,利用Hoffman通用引物[6]作为反转录引物,AMV酶反转录合成cDNA。PB1的CDS区引物:PB1-F:5′TATGTCGACATGGATGTCAATCCG3′;PB1-R:5′CAGGGATCCCTATT T TTGCCGTCT3′。RT-PCR扩增出大约2 300 bp的条带,利用SalⅠ和BamHⅠ双酶切亚克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表达载体上,PCR和酶切鉴定获得阳性克隆。

1.2.2 Western blot检测PB1的真核表达 构建好的重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-PB1经大提试剂盒纯化后,测定质粒浓度。根据 lipofectamine 2000转染试剂盒说明书的操作步骤,转染2 μ g质粒进3×105个细胞中,同时转染 p3xFLAG-CMV-7.1空载体和p3xFLAG-CMV-7.1-M1质粒作为对照。转染24 h后,收集细胞样品,细胞裂解总蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜后,一抗用小鼠抗FLAG抗体,二抗采用羊抗小鼠H RP,利用ECL发光试剂盒进行显色。

1.2.3 间接免疫荧光进行PB1蛋白的亚细胞定位Vero细胞在飞片上长成单层,然后转染p3xFLAG-CMV-7.1-PB1真核表达质粒(操作按试剂盒说明书进行),经甲醛和甲醇(1∶1)固定,一抗用小鼠抗FLAG抗体,二抗用羊抗小鼠FITC标记的荧光抗体,正置荧光显微镜下拍照。

2 结果

2.1 真核表达质粒酶切鉴定结果

RT-PCR扩增出 PB1基因全长 CDS区,大约2 300 bp,亚克隆至真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1中,转化大肠埃希菌DH5α,挑克隆后小提质粒,用SalⅠ和BamHⅠ双酶酶切鉴定(图1)。同时测序,鉴定结果与NCBI上公布的SIV序列99%同源性。

图1 p3xFLAG-CM V-7.1-PB1酶切鉴定Fig.1 Identification of p3x FLAG-CMV-7.1-PB1 plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 Western blot检测PB1的真核表达

重组载体p3xFLAG-CMV-7.1-PB1转染Vero细胞,收取细胞总蛋白样品,以FLAG抗体做一抗Western blot检测PB1的表达(图2),以p3xFLAGCMV-7.1-M1作为对照,actin抗体显色作为上样量的参照,结果显示在90 ku大小左右有一条特异带,证明该蛋白在真核细胞中得到表达。

图2 Western blot检测重组蛋白FLAG-PB1的表达Fig.2 The expression detection of recombinant protein FLAG-PB1 by Western blot

2.3 PB1蛋白的亚细胞定位

真核表达质粒 p3xFLAG-CMV-7.1-PB1转染Vero细胞,甲醛固定后,一抗用小鼠抗FLAG抗体,做好飞片后,在荧光显微镜下拍照(图3),结果显示绿色代表重组蛋白FLAG-PB1,其表达主要在细胞核内,蓝色显示的是细胞核。

3 讨论

图3 重组蛋白FLAG-PB1的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of recombinant FLAG-PB1 protein

本研究利用带FLAG标签的真核表达载体在真核细胞Vero中表达,Western blot结果表明建立PB1蛋白真核表达系统,间接免疫荧光结果表明PB1蛋白在真核细胞的细胞核内表达,与以前研究人流感病毒该蛋白结果一致,是与其发挥复制酶功能密切相关,为下一步流感复制机理的研究做了前期工作。1956年和1968年流感病毒就是因为禽流感病毒PB1片段的替换引起病毒复制效率大大提高,造成毒力上升,致病性增加[7]。高致病性禽流感病毒H5N1其PB1蛋白与病毒复制效率密切相关,是一个重要的毒力因子[8]。近来在流感病毒单个基因替换的研究中发现PB1蛋白与病毒毒力密切相关[9],为研究流感病毒的毒力因子打开了另一扇大门,也为防控流感病毒探索了新的研究方向。流感病毒复合酶是一个异源多聚体组成,其中PB1、PB2、PA按照1∶1∶1组成发挥转录作用。PB1蛋白具有RNA依赖RNA聚会酶的结构模式,已经验证其几个主要的结构域,其N端80个氨基酸是与PA亚基密切相互作用的结构域,C端则负责与PB2结合,其中506位点和659位点对这种结合也是非常关键位点[10]。其绑定病毒vRNA的区域也在近期得到了验证[11],这些研究为揭开流感病毒复制机制奠定了良好的基础。

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Subcellular Localization of Swine Influenza Virus PB1 Protein

WANG Xiao-du,CHEN Pei-jun,SHEN Yang,MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Shanghai,200241,China)

PB1 protein of influenza virus plays an important role in virus replication.In this paper,the swine influenza virus PB1 gene was cloned into eukaryotic expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1,the recombination expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1-PB1 was transfected into Vero cells by liposome,the expression of FLAG-PB1 was detected by Western blot and IFA.The result showed that the protein was expressed in eukaryotic cell and its subcellular locus is in nucleus,which is association with its function.The result provides a basis for influenza virus research.

Swine influenza virus;PB1 protein;subcellular localization

S852.659.5;S858.28

A

1007-5038(2010)01-0021-03

2009-07-09

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2007JB02);上海市浦江人才计划项目(07pj14109)

王晓杜(1973-),男,湖北红安人,博士研究生,主要从事病毒与细胞相互关系研究。*通讯作者