大孔吸附树脂提取分离去甲基万古霉素的工艺研究

去甲基万古霉素是我国唯一一个自主研制并成功应用于临床的糖肽类抗生素，其结构比万古霉素在亮氨酸部位少 1 个甲基，见图1。

图1 去甲基万古霉素结构式

去甲基万古霉素具有和万古霉素相同的抗菌谱和相似的抗菌活性，对耐青霉素G及多种抗生素的金葡球菌、表球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球菌及肠球菌等均有强大的抗菌作用,对厌氧的难辨梭状芽孢杆菌亦有较好的抗菌作用,对炭疽杆菌、白喉杆菌等亦敏感,属速效杀菌药[1]。

目前万古霉素的分离纯化方法有大孔树脂吸附分离法[2]、沉淀法[3]、色谱制备法[4]、磁性亲和吸附法[5]、双水相萃取法[6]、反胶团萃取法[7]等，也可将其中几种方法综合运用[8]。色谱制备法、磁性亲和吸附法成本较高，双水相萃取法、沉淀法、反胶团萃取法影响因素较复杂，提取率不高。大孔树脂吸附分离法较其它方法具有一定的优越性：(1)影响因素少，工序简单，操作方便；(2)提取率高，去除杂质能力强；(3)适用于工业化生产。由于去甲基万古霉素和万古霉素物化性质极为接近，因此，作者采用大孔树脂吸附分离法提取发酵液中的去甲基万古霉素，并优化了相关的工艺参数。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

发酵液，华北制药新药公司。

去甲基万古霉素对照品，SIGMA公司；乙醇、盐酸、氢氧化钠均为工业级；HZ801型、HZ802型、HZ803型、HZ820型、HZ816型树脂，上海华震公司；NKA型、S-8型树脂，南开大学化工厂；XAD-16型树脂，上海罗门哈斯化工公司。

高效液相色谱仪，Waters公司。

1.2 预处理

1.2.1 发酵液预处理

取发酵液加2 mol·L-1盐酸调pH值至3.5，然后加入一定量的助滤剂过滤，滤液作为上柱液备用。

1.2.2 树脂的预处理/再生

新(再生)树脂首先用4 BV工业酒精浸泡24 h,用纯化水洗至无醇味；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液搅拌浸泡3 h，用纯化水洗至中性；然后用3 BV 2 mol·L-1HCl溶液搅拌浸泡3 h,用纯化水洗至中性；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液浸泡3 h，用纯化水洗至中性，待用。

1.3 吸附条件研究

1.3.1 树脂的筛选

取已处理好的8种树脂,分别装入50 mL树脂柱(R∶H=1∶5)中,取同一批号的去甲基万古霉素上柱液，分别在常温下以1.5 BV·h-1的流速上样，保证树脂吸附饱和或过饱和，分别测定饱和吸附量。

式中:V0为湿树脂体积；c0为上柱液浓度；c1为10%上柱液浓度；V1为当流出液浓度为10%上柱液浓度时的流出液总体积。

1.3.2 动态吸附实验

将去甲基万古霉素上柱液用水稀释成浓度为0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、2.2 mg·mL-1、2.8 mg·mL-1的上样液，以1.5 BV·h-1的流速上样，考察上样液浓度对树脂动态饱和吸附量的影响。

分别用5%盐酸或10%的氢氧化钠将去甲基万古霉素上柱液 (浓度为2.2 mg·mL-1，pH值为3.5)的pH值调至3.0、4.0、6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0，以1.5 BV·h-1的流速上样，考察上样液的pH值对树脂动态饱和吸附量的影响。

将pH值为9.0、浓度为2.2 mg·mL-1的去甲基万古霉素上柱液上HZ816树脂柱吸附，上样流速(BV·h-1)分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3和4，考察上样流速对树脂动态饱和吸附量的影响。

1.4 解吸条件研究

选用甲醇、乙醇、丙酮三种溶剂进行静态解吸，筛选效果最好的解吸剂。

取一定量的HZ816树脂湿法装入100 mL玻璃树脂柱(R∶H=1∶5)中，通上样液吸附，当流出液浓度接近上样液浓度10%时，认为树脂已吸附饱和并停止上样，用纯化水洗涤树脂后，然后选用5%乙醇-0.1%盐酸-水、10%乙醇-0.1%盐酸-水、15%乙醇-0.1%盐酸-水、20%乙醇-0.1%盐酸-水、25%乙酸-0.1%盐酸-水解吸，解吸流速控制在100 mL·h-1，合并高浓度的解吸液，并以HPLC检测流出液浓度。

1.5 HPLC色谱条件

色谱条件：色谱柱 Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为40℃，流动相为乙腈∶0.05 mol·L-1KH2PO4=8∶92(体积比)，流速1.0 mL·min-1；检测波长280 nm，进样量20 μL。在该色谱条件下去甲基万古霉素的保留时间为9.5 min。

称取27 mg去甲基万古霉素对照品配制成50 mL水溶液，取对照品溶液20 μL注入色谱仪，按上述色谱条件进行测定，按外标法计算峰面积。本方法测得去甲基万古霉素平均回收率为99.8%(n=5)，RSD=0.15%；精密度为99.88%(n=5)，RSD=0.20%。

2 结果与讨论

2.1 树脂筛选结果

实验中测得8种大孔树脂的饱和吸附量，结果见表1。

表1 8种大孔树脂的饱和吸附量

从表1可见，HZ816树脂的饱和吸附量最高。因此，选取HZ816型树脂作为去甲基万古霉素的吸附树脂。

2.2 吸附条件对HZ816树脂动态饱和吸附量的影响

2.2.1 上样液浓度(图2)

图2 上样液浓度对HZ816树脂动态饱和吸附量的影响

由图2可以看出，去甲基万古霉素浓度对HZ816树脂动态饱和吸附量有一定的影响。当上样液浓度较低(如0.8 mg·mL-1)时，树脂动态饱和吸附量较低，这说明仍有部分树脂未参与吸附过程，树脂使用率不高；当上样液浓度为2.2 mg·mL-1时，树脂动态饱和吸附量最高；而当上样液浓度过高时，树脂动态饱和吸附量也稍有下降，这可能是由于一些杂质与万古霉素竞争吸附，从而影响了树脂对万古霉素的吸附。选择较适上样液浓度为2.2 mg·mL-1。

2.2.2 上样液pH值(图3)

图3 上样液pH值对HZ816树脂动态饱和吸附量的影响

由图3可以看出，上样液pH值为9.0时，HZ816树脂对去甲基万古霉素的动态饱和吸附量较高。这可能是由于去甲基万古霉素呈弱碱性，在弱碱性条件下能够保持分子状态，较易被吸附。因此，选择较适上样液pH值为9.0。

2.2.3 上样流速(图4)

图4 上样流速对HZ816树脂动态饱和吸附量的影响

由图4可以看出,当上样流速超过2.5 BV·h-1后，树脂动态饱和吸附量逐渐下降。流速越慢,吸附越好；但流速过慢会延长生产周期,提高成本。因此，选择较适的上样流速为2 BV·h-1。

2.3 解吸条件的确定

2.3.1 解吸溶剂的选择

解吸实验结果表明,乙醇和甲醇均具有较好的解吸能力,因乙醇毒性远远低于甲醇,故选用乙醇作为吸附树脂的解吸溶剂。

2.3.2 解吸剂的确定(表2)

表2 解吸实验结果

由表2可知，用较低含量乙醇解吸时解吸拖尾严重，解吸率低，这可能是由于有机溶媒含量低时，一方面树脂的溶胀度不够，去甲基万古霉素从内孔的溶出受阻，另一方面流动相对去甲基万古霉素的溶解度低，致使其难以进入流动相而滞留于树脂；随着乙醇含量的上升，解吸率明显增加，所需解吸液体积减少。用15%乙醇-0.1%盐酸-水解吸时,解吸液甲基万古霉素的色谱纯度最高，表明此时的杂质最少。综合考虑解吸率和解吸液色谱纯度，选取15%乙醇-0.1%盐酸-水作为解吸剂。

2.4 工艺验证

本工艺经过5批中试放大，结果表明：大孔吸附树脂HZ816可以很好地提取分离去甲基万古霉素，动态饱和吸附量达36.1 mg·mL-1，可将发酵液中去甲基万古霉素浓度富集15倍左右；纯化水洗树脂柱后，采用15%乙醇-0.1%盐酸-水溶液对树脂柱解吸，解吸液去甲基万古霉素较集中，基本不拖尾，平均解吸率92.0%；去甲基万古霉素色谱纯度由发酵液的低于20%提高到解吸液的85.0%，表明发酵液中大量色素、蛋白、多糖等杂质得以有效去除，为后续进一步纯化精制打下了良好的基础。

3 结论

选择HZ816型树脂为去甲基万古霉素的吸附树脂，在上样液浓度为2.2 mg·mL-1、pH值为9.0、上样流速为2 BV·h-1的最佳吸附条件下，HZ816型树脂对去甲基万古霉素的吸附量达36.1 mg·mL-1；采用15%乙醇-0.1%盐酸-水即可将吸附在树脂柱上的去甲基万古霉素有效解吸，解吸率达92.0%。该工艺简单、易操作，适用于工业化生产。

参考文献：

[1] 金有豫.药理学[M].北京：人民卫生出版社,2001：333-335.

[2] 陈代杰,李继安,邹韵华，等.万古霉素的研究开发[J].中国抗生素杂志,2004,29(1):8-10.

[3] 哈罗德·蒙·卡特,哈罗德·伯纳德·海斯.改进的万古霉素沉淀法[P].CN 10 212 280 C,1993-06-16.

[4] Grahek Rok,Bastarda Andrej.Chromatographic purification of va-ncomycin hydrochloride by use of preparative HPLC[P].USP 5 854 390 A,1998-12-29.

[5] 郭立安,朱宝泉,陈代杰.万古霉素的磁性亲和吸附分离[J].生物工程学报,2001,17(5):584-586.

[6] 张巧,张奇,杨艺虹.双水相萃取技术应用在医药工业中的展望[J].医药工程设计杂志,2001,22(5):22-26.

[7] 段金友,方积年.反胶束萃取分离生物分子及相关领域的研究进展[J].分析化学,2002,30(3):365-371.

[8] Pflaum Zlatko,Turkalj Kobert.Combined process for the purification of vancomycin hydrochloride[P].USP 5 853 720 A,1998-12-29.