雌二醇对全脑缺血再灌注大鼠海马 CA1区凋亡调节蛋白 Bcl-2/Bax的影响

杨福义,周 雷,杨文佳,杨 军

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学2007级研究生,黑龙江 佳木斯 154007)

缺血性脑血管疾病是目前高发的严重危害人类健康的主要神经系统疾病。流行病学研究表明,绝经前女性脑梗死的发生率低于同龄男性,绝经后其脑梗死发生率则明显升高。大量的流行病学调查及动物实验显示,雌二醇(E2)具有减少脑梗死发作和削减梗死体积的作用,近年来,国内外学者对雌激素做了大量的实验研究,但雌激素的脑保护机制仍未阐明。本文主要研究雌二醇对全脑缺血再灌注大鼠海马区细胞的影响以及凋亡相关蛋白 Bcl-2/Bax的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

健康 雌性 Wistar大鼠,体重 200～ 230g,共 60只 ,佳 木斯大学实验动物中心提供。主要试剂：Bax兔抗鼠单克隆抗体,Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体,二步法免疫组织化学检测试剂,DAB显色剂,(Tunel)原位细胞凋亡检测,以上试剂均购于北京中杉金桥生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

A组(卵巢切除,但不全脑缺血再灌注)10只;B组(卵巢切除+全脑缺血再灌注)25只;C组(卵巢切除+全脑缺血再灌注+17-β雌二醇治疗组)25只。其中 B组和 C组又随机分为5个亚组,每组 5只大鼠,分别为缺血15min再灌注1h、6h、12h、24h、72h组。B、C组卵巢切除后 2周建立全脑缺血再灌注模型;C组切除双侧卵巢后每日给予腹腔注射17-β雌二醇(17β-E2)1mg/kg,共 14d,其余各组每天给予生理盐水注射。

1.2.2 动物模型的建立

卵巢切除模型的制作：用10%水合氯醛腹腔麻醉,待动物麻醉完毕后于下腹部剃毛、消毒、铺无菌巾。采用下腹部正中切口2.5～ 3cm,无菌条件下,用镊子探入腹腔,夹取卵巢,结扎输卵管,切除双侧卵巢,止血彻底后用庆大霉素腹腔注射,逐层缝合切口 ,放回笼中,待其恢复。全脑缺血再灌注模型的制作：大鼠腹腔注射10%水合氯醛,将大鼠俯卧,备皮,消毒。在枕骨下平行于脊柱沿颈背正中线切开皮肤和皮下肌肉直至第一颈椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置将烧灼的细针直接插入翼突孔 ,插入时间不宜过长,1～ 2s即可。缝合肌肉及皮肤。行颈部正中切口,于双侧颈动脉鞘处分离出双侧颈总动脉,待3h大鼠清醒后 ,用无创微血管夹夹闭双侧颈总动脉 ,阻断血流 15min,造成脑缺血状态,然后放开血管夹,使脑血液循环恢复。预定时间取材。

1.2.3 标本制备

于再灌注时间点大鼠麻醉后,剪开腹壁 ,暴露心脏。用灌注穿刺针刺入左心室至主动脉根部,止血钳固定。右心耳处剪一小口,用温生理盐水约 100mL灌注,再用4℃预冷的4%多聚甲醛磷酸缓冲液约200mL灌注,断头取脑,于视交叉和乳头体之间取2～ 3mm组织块,固定于甲醛溶液中,自来水冲洗,酒精脱水,石蜡包埋、切片机做连续冠状面切片。

1.2.4 免疫组化及 TUN EL法检测

免疫组化法检测 Bcl-2/Bax在雌性大鼠海马 CA1区表达。Tunel法检测其细胞凋亡数。

1.2.5 数据收集

于400倍光镜下计数海马 CA1区阳性细胞数及总细胞数,计算阳性细胞率 (阳性细胞率=阳性细胞数 /总细胞数×100%)。每张切片计数4个不重叠视野,取平均值。

1.3 统计学分析

数据均以均数±标准差表示。采用 SPSS17.0统计软件分析,组间比较用方差分析。P ＜0.05为有统计学意义。

2 结果

见表 1。

表1 各组海马区 Bcl-2/Bax及 Tunel阳性细胞数 ±s)

表1 各组海马区 Bcl-2/Bax及 Tunel阳性细胞数 ±s)

Bcl-2组内比较：不同时间点 B组和 C组与 A组比较,A vs B1、B2、B3、B4、C2、C3、C4、C5(P ＜ 0.05)。同时间点 B组与 C组比较 ,B1vs C1,B2 v s C2,B5 vs C5(P ＜ 0.05)。 Bax组内比较：不同时间点 B组和 C组与 A组比较 ,A vs B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5(P ＜0.05)。同时间点 B组与 C组比较,B4v s C4,B5vs c5(P＜0.05)。Tunel组内比较：不同时间点 B组和 C组与 A组比较,A v s B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2(P ＜ 0.05)。同时间点 B组与 C组比较,B1 vs C1,B2 vs C2,B3 vs C3,B4 vs C4,B5 v s C5(P ＜ 0.05)。

组别 Bcl-2 Bax Tunel A(对照组 ) 11.36±0.72 29.71±1.44 33.05±2.09 B1(缺血再灌注 1h) 8.21±0.87 17.52±1.57 37.15±1.23 B2(缺血再灌注 6h) 29.27±1.53 20.00±2.03 38.71±1.38 B3(缺血再灌注 12h) 34.32±0.99 21.84±1.45 42.11±1.15 B4(缺血再灌注 24h) 27.09±2.14 26.26±1.57 67.31±4.25 B5(缺血再灌注 72h) 11.44±1.44 31.60±1.91 52.55±2.27 C1(再灌 1h+ 雌二醇治疗)12.96±0.89 16.24±2.78 23.68±1.66 C2(再灌 6h+ 雌二醇治疗)41.96±2.30 19.04±1.23 17.77±2.16 C3(再灌 12h+ 雌二醇治疗 )36.05±1.59 20.13±0.92 31.07±2.82 C4(再灌 24h+ 雌二醇治疗 )31.77±2.45 21.15±1.68 38.73±7.44 C5(再灌 72h+ 雌二醇治疗 )22.12±2.38 17.02±1.29 30.56±6.07

3 讨论

凋亡是脑缺血后细胞死亡的主要形式。Bcl-2通过形成同源或异源二聚体与 Bax结合,抑制 cyto C的释放及Caspase3、9的活化,从而拮抗凋亡。尽管细胞内 Bcl-2/Bax的比例是固定的,但在外界刺激或生理状况异常时,同源或异源二聚体的量会发生变化。Bcl-2大量表达时,形成 Bcl-2同源二聚体,凋亡受到抑制;Bax大量表达时,则形成 Bax同源二聚体,细胞趋向凋亡。而当 Bcl-2与 Bax形成异源二聚体时,Bcl-2也可以发挥其抗凋亡活性。本实验中雌二醇治疗组在缺血再灌注1h、6h、72h点与对照组及脑缺血再灌注组相比 Bcl-2表达明显增高。Bax在雌二醇治疗组再灌注时间点24h、72h表达明显降低。其中雌二醇治疗组每个时间点的细胞凋亡数都低于同时间点缺血再灌注组。通过以上数据表明雌二醇很有可能是通过调节 Bcl-2/Bax来抑制全脑缺血再灌注细胞凋亡,从而对脑细胞发挥保护作用。雌激素预处理能减轻脑缺血再灌注损伤的程度,但其作用机制还不十分清楚,可能是多因素的,与脑损伤部位、严重程度及循环中雌激素浓度等有关,涉及基因和非基因因素、血流和非血流调节机制、受体和非受体介导的机制。部分学者[1,2]认为通过非依赖的血流机制如抗过氧化作用、减少细胞内钙蓄积、抑制 NMDA介导的神经兴奋毒性损伤、提高神经营养因子受体表达、活化细胞分裂素活化蛋白激酶信号途径、上凋抗凋亡基因 Bcl-2表达等发挥积极作用。还与抗炎、调节蛋白质合成、抑制细胞凋亡、维持局部缺血区的微血管血流供应有关,可能是雌激素与特定的雌激素受体结合后调节基因表达,对血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经元及神经胶质细胞产生了远期效应[3]。但雌二醇保护脑细胞免受损害的具体机制有待进一步研究。

[1]Dubal DB,Wise PM.Neuroprotectiv e effects of estradiol in middle aged female rats[J].Endocrinology,2001,142(1)：43-48

[2]Alkayed N J,Murphy SJ,Traystman RJ,et al.Neuroprotectiv e effects of female gonadal steroids in reproductively senescent female rats[J].Stroke,2000,31(1)：161-168

[3]Alonso de Lecinana M,Egido JA.Estrogens as neuroprotectants against ischemic stroke[J].Cerebrovasc Dis,2006,21(2)：48-53