丹酚酸B对活化的系膜细胞TGF－β1受体和Smad2表达的影响*

刘煜敏， 张 悦△，陆海英， 郝艳鹏， 陆敏

(上海中医药大学1科技实验中心，2护理学院，上海 201203)

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是从临床常用的活血化瘀中药丹参中提取的水溶性成分，整体动物实验表明，Sal B 具有一定的抗肝、肾纤维化作用［1，2］，但其具体作用环节尚不清楚。在肾纤维化的肾小球部位，活化的系膜细胞是产生细胞外基质的主要细胞。本研究以此作为切入点，观察Sal B对活化系膜细胞的影响并结合肾纤维化中转化生长因子－β(TGF－β)/Smad这一重要信号通路初步探讨其作用机制。

材料和方法

1 药品与试剂

Sal B购自中国药品生物制品检定所，批号为111562－200807;重组人转化生长因子1(transforming growth factor－ β1，TGF － β1)购自 Millipore;DMEM高糖培养基、F12培养基、胎牛血清、胰酶购自Hyclone;α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)单抗购自Sigma;转化生长因子Ⅰ型受体(TGF－β1receptorⅠ，TβRI)多抗、转化生长因子Ⅱ型受体(TGF－β1receptorⅡ，TβRII)多抗购自Santa Cruz;磷酸化 Smad2单抗、Smad2单抗购自 Cell Signal;Smad7单抗购自R＆D;甘油醛－3－磷酸脱氢酶免疫球蛋白G偶联辣根过氧化物酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase immunoglobulin G horse radish peroxidase，GAPDH IgG －HRP)单抗购自上海康成生物公司;预染蛋白标记物购自Fermentas;二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、化学发光底物(Super SignalWestern Pico chemiluminescent substrate，ECL)试剂盒购自 Pierce。

2 方法

2.1 大鼠肾小球系膜细胞培养 具体步骤参照参考文献［3］。乙醚麻醉饥饿过夜雄性大鼠(150 g左右)，无菌操作取肾皮质，于Hank's液中洗涤后剪碎，过80目和150目筛网，下接200目筛网。用移液管从200目筛网上吸取肾小球，转移到试管中。试管垂直静置10－15 min使肾小球自然下沉后弃上清。加入IV型胶原酶，37℃消化20 min后弃上清。加入培养液10 mL，悬浮肾小球，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。3－4 d内勿触动培养瓶，此后每周换液2次，待80% －90%细胞融合后进行实验。

2.2 蛋白免疫印迹分析 用上样缓冲液裂解6孔板细胞，收集后煮沸变性10 min。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate － polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)后转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲溶液(Tris buffer solution，TBS)室温封闭1 h，然后分别加入 α －SMA 抗体(1∶3000)、TβRI抗体(1∶200)、TβRII抗体(1∶400)、p － Smad2(1∶1000)抗体、Smad2(1∶1000)抗体、Smad7 抗体(1∶1000)、GAPDH抗体(1∶5000)，4℃孵育过夜。洗膜后再用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的 IgGⅡ抗(1∶5000)杂交，室温孵育1 h。再次洗膜后用ECL试剂显色并曝光成像。利用图像分析系统扫描确定X光片上的杂交条带的吸光度值。

2.3 细胞免疫荧光染色 细胞培养于24孔板内无菌处理的盖玻片上，各组干预结束，再用预冷PBS洗2遍后，再用预冷4%多聚甲醛固定10 min。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗2遍后用含0.5% 小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS室温封闭30 min，Ⅰ抗4℃孵育过夜，PBS洗3遍后用Alex 536抗小鼠荧光Ⅱ抗室温标记1 h，PBS洗3遍后用含4’，6－二脒基 －2－苯基吲哚(4’，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)的封片剂封片，避光自然干燥后荧光显微镜(Nikon E600FN)观察。

3 统计学处理

结 果

1 Sal B对系膜细胞活化的影响

Figure 1.Effect of Sal B on α － SMA expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5 mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF－β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF－β1+10 －6mol/L Sal B group.图1 Sal B对系膜细胞α－SMA表达的影响

α－SMA蛋白明显表达和系膜细胞胞体增大是系膜细胞活化的重要标志。图1显示，TGF－β1刺激系膜细胞24 h即可见显著表达α－SMA及胞体增大表现，提示TGF－β1成功诱导系膜细胞活化。而在10－5mol/L和10－6mol/L Sal B组及其与 TGF－β1共刺激组均未见系膜细胞活化表现。

2 TGF－β1刺激系膜细胞活化对Smad2磷酸化及Smad7蛋白表达的影响

由图2可见，随TGF－β1刺激时间延长，Smad2分子呈现明显磷酸化活化。与对照组比较，TGF－β1刺激系膜细胞 15 min、30 min、60 min、120 min、360 min均可见 Smad2显著磷酸化(P＜0.05)。总Smad2和Smad7蛋白表达在TGF－β1刺激各时点未见明显变化(P＞0.05)。

Figure 2.Effects of treatment for different time of 5 μg/L TGF －β1on Smad2 phosphorylation，Smad2 and Smad7 protein expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF－β115min group;C:TGF－β130min group;D:TGF－β160min group;E:TGF－β1 120min group;F:TGF－β1360min group..n=4.*P ＜0.05 vs control group.图2 TGF－β1刺激不同时点对系膜细胞Smad2磷酸化、Smad2、Smad7表达的影响

3 Sal B对系膜细胞TGF－β1两型受体及Smad2磷酸化的影响

由图3可知，TGF－β1刺激组TβRI表达(0.784±0.110)、TβRII表达(0.576 ±0.085)分别高于对照组(0.501±0.125)、(0.074±0.033)，且组间比较差异显著(P＜0.05)。而Sal B可显著抑制TGF－β1刺激引起的此两型受体表达增多。由图3可知，TGF－β1刺激后可引起系膜细胞Smad2显著磷酸化(P＜0.05);而Sal B可抑制这种效应。但TGF－β1刺激和Sal B干预对于系膜细胞中Smad2分子的蛋白表达均未见显著影响。

Figure 3.Effects of Sal B on TGF－β1receptors and Smad2 expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF － β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF － β1+10－6mol/L Sal B group..n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs TGF－β1group.图3 Sal B对活化系膜细胞TβRI、TβRII、Smad2磷酸化及Smad2表达的影响

讨 论

作为肾小球内的主要细胞类型之一，系膜细胞在维持基膜的更新与修复、调节肾小球血流量、支持毛细血管壁等方面发挥重要作用。包括TGF－β1和胰岛素［4］在内的许多细胞因子以及高糖、高脂［5，6］等刺激都能调节系膜细胞由休眠向基质过度产生的活化状态的表型转化，促进细胞外基质的过度产生。系膜细胞的活化是以α－SMA表达诱导和基质过度产生为特点的［7］。在肾脏中，高亲和力的TGF－β受体主要在小球上皮细胞(足细胞)和系膜细胞表达［8］。

肾小球系膜细胞活化是肾小球肾炎、糖尿病肾病、肾纤维化等多种肾脏疾病发生发展过程中的共性事件。因此，抑制系膜细胞活化的研究也是治疗这些肾脏病的一个切入点。Wang等［9］发现在系膜细胞中骨形成蛋白7(bone morphed protein，BMP－7)具有与TGF－β1相反的作用，主要是通过调控TGF－β/Smad通路实现的，不需要 Erk1/2、p38或JNK等信号参与。Dai等［10］研究表明在系膜细胞中，肝细胞生长因子能够稳定Smad转录共抑制子TGIF而特异性拮抗TGF－β1的促纤维化效应。

近年来对于小分子物质Sal B(分子量718)的药理作用研究也不仅仅局限于其抗氧化作用。不断有研究表明，Sal B对多种细胞在遭受刺激或损伤时均具有一定的保护作用。在神经细胞缺糖缺氧/复糖复氧的损伤过程中，Sal B能够维持钙稳态，提高基质金属蛋白酶，降低细胞凋亡率［11］。Liu 等［12］的研究表明Sal B通过调控PI3K/Akt/Raf/MEK/ERK信号通路保护大鼠脑微血管内皮细胞免受H2O2诱导的凋亡。在系膜细胞中，Sal B能抑制呈剂量依赖性高糖诱导系膜细胞增殖与细胞外基质沉积，其作用机制是通过抑制NF－κB激活调控细胞周期进程和金属基质蛋白酶活性而实现的［13］。

本研究首先对TGF－β1刺激系膜细胞后其表型转化标志蛋白α－SMA的表达做一检测，免疫荧光观察结果与蛋白免疫印迹分析结果一致提示Sal B对TGF－β1刺激引起的系膜细胞活化有拮抗作用。然后分别检测了TGF－β1激活系膜细胞后对Smad通路的受体型和抑制型Smad分子的影响，结果提示Smad2明显磷酸化而活化，总Smad2和Smad7表达无显著变化。随后，本研究对Sal B抑制系膜细胞活化的机制做一简单探讨。实验结果提示Sal B能够抑制TGF－β1两型受体表达和Smad2磷酸化活化。此前也已有体外实验表明一些小分子天然产物，如姜黄素，具有拮抗肾脏细胞TGF－β1两型受体表达从而减少细胞外基质成分沉积的作用［14］。

综上所述，在TGF－β1刺激系膜细胞活化的病理过程中，Sal B能够抑制 TβRI、TβRII表达，抑制TGF－β/Smad信号通路激活，拮抗系膜细胞活化。Sal B对系膜细胞内源性的TGF－β1两型受体蛋白表达和Smad2磷酸化的抑制作用可能是其发挥抗肾纤维化作用的细胞学靶标之一。

［1］刘 平，朱大元，胡义扬，等.丹参酸乙抗慢性乙型肝炎肝纤维化的研究［J］.医学研究通讯，2003，32(2):16－17.

［2］陆海英，张 悦，刘煜敏，等.丹参酚酸B对肾纤维化大鼠肾组织MMP－2表达的影响［J］.上海中医药大学学报，2009，23(2):55 －58.

［3］李 才.器官纤维化－基础与临床［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，2003.174 －175.

［4］姜华军，朱忠华，刘建社，等.胰岛素对高糖培养的人系膜细胞表达SGK1及合成细胞外基质的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(3):330 －333.

［5］王丽晖，段惠军，吴广礼，等.高糖诱导大鼠系膜细胞CTGF mRNA的表达及机制探讨［J］.中国病理生理杂志，2009，25(8):1644 －1646.

［6］周素娴，雷闽湘，赵晋晋，等.高糖高脂对系膜细胞产生细胞外基质及PAF的影响［J］.中国病理生理杂志，2009，25(10):2056 －2057、2072.

［7］Schnaper HW，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF －beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(2):F243 －F252.

［8］Kushibiki T，Nagata － Nakajima N，Sugai M，et al.Delivery of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF－beta type II receptor by cationized gelatin to prevent interstitial renal fibrosis［J］.J Control Release，2005，105(3):318－331.

［9］Wang S，Hirschberg R.Bone morphogenetic protein －7 signals opposing transforming growth factor β in mesangial cells［J］.J Biol Chem，2004，279(22):23200 －23206.

［10］Dai C，Liu Y.Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF－beta1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(6):1402 －1412.

［11］汪 芸，蒋玉凤，黄启福，等.丹酚酸B保护缺糖缺氧复糖复氧神经元的作用机制研究［J］.中国病理生理杂志，2009，25(2):275 －279.

［12］Liu CL，Xie LX，Li M，et al.Salvianolic acid B inhibits hydrogen peroxide－induced endothelial cell apoptosis through regulating PI3K/Akt signaling［J］.PLoS ONE，2007，2(12):e1321 － e1328.

［13］Luo P，Tan ZH，Zhang ZF，et al.Inhibitory effects of salvianolic acid B on the high glucose－induced mesangial proliferation via NF － κB － dependent Pathway［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(7):1381 －1386.

［14］Gaedeke J，Nobole NA，Border WA.Curcumin blocks multiple sites of the TGF－β signaling cascade in renal cells［J］.Kidney Int，2004，66(1):112 － 120.