肾素前体激活人肾系膜细胞ERK1/2诱导TGF－β的表达*

宋玮， 陈佳， 张英， 任丽丽， 米芋枚， 路岩， 姜一农

(大连医科大学附属第一医院心内科，辽宁 大连 116027)

Nguyen等［1］于2002年首次报道在肾系膜细胞克隆出了肾素(前体)受体，迄今为止已克隆出了2种受体。其中6磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ受体［mannose－6－phosphate/insulin like growth fac-torⅡ(IGFⅡ)receptor，M6P/IGF2R］被认为是prorenin的清除机制。Prorenin与之结合后产生一种内化效应被降解，M6P/IGF2R决定了细胞外prorenin的水平［1］。另一种是功能型的受体肾素(前体)受体［(pro)renin receptor，(P)RR］，这种受体是含有350个氨基酸的蛋白质，具有1个跨膜区域，与其它的已知蛋白没有同源性，在物种之间有高度保守性［1］。Nguyen最初以免疫荧光方法观察到(P)RR存在于肾系膜细胞、冠状动脉和肾动脉平滑肌细胞中，目前认为在心脏、肾脏、脑和胎盘组织(P)RR mRNA均以高水平表达［2］。(P)RR过度激活后参与激活细胞间信号转导通路，上调一些基因表达，同时增强(pro)renin的酶活性［3］。随着人们对RAS系统的深入研究，(P)RR已经成为伴有RAS系统过度激活相关肾病的热点问题之一。

Prorenin的前肽片段包含一控制区域(handle region)，此控制区域是与受体结合的部位。人们依据prorenin前肽片段与受体结合的关键部位的氨基酸序列，设计出了1个肽片段，利用生物技术合成了十肽片段HRP(handle region peptide)。HRP模仿控制区域的序列，竞争性与受体结合［4］，故被认为是(P)RR的阻断剂，但目前还没有确切的证据证明。

(P)RR在物种间具有高度保守性［1］，目前虽然已有许多动物模型实验证据证明(P)RR在心肌纤维化、肾小球硬化中发挥着独立的病理作用，但尚无(P)RR在人类各脏器致病作用的报道。肾系膜细胞(human renal mesangial cells，HRMCs)增殖是高血压肾病和糖尿病肾病的共同特点，其增殖和内分泌功能在高血压肾病和糖尿病肾病发展中起着重要的作用。本研究旨在观察prorenin对体外培养的人肾系膜细胞ERK 1/2信号通道的活化作用及促纤维化因子转化生长因子(transfer growth factor－β，TGF－β)表达的影响，并通过p－ERK 1/2和TGF－β的水平研究HRP是否具有(P)RR的阻断作用。

材料和方法

1 材料

Prorenin购自Sigma。HRMCs及MCM培养液购自ScienCell。TGF－β ELISA试剂盒购自武汉博士德有限公司。细胞总RNA提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。TGF－β PCR试剂盒及引物购自中国大连TaKaRa生物工程有限公司。兔抗人p－ERK、ERK抗体，羊抗兔－HRP抗体购自Santa Cruz。

2 HRMCs的培养

按照HRMCs说明书培养于MCM培养液，培养条件37℃、5%CO2。细胞长至80% －90%，弃培养液，加入0.025%胰蛋白酶37℃消化1－2 min，显微镜下观察，大部分细胞变圆近脱壁时，加入含10%FBS的培养液终止反应，收集细胞悬液至离心管中，1000 r/min离心5 min。弃上清，加入MCM培养液制成细胞悬液，计数后接种至新培养瓶中继续培养，取3－6代实验用。

3 测定培养液中TGF－β

采用双抗体夹心ELISA法。将标准品和样品加入包被TGF－β单抗的酶标板上，按试剂盒操作。反应终止后，在492 nm处测A值，TGF－β浓度与A值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TGF－β浓度。

4 TGF－β mRNA表达测定

采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR)方法。

4.1 细胞 RNA抽提 按照 Trizol说明书提取HRMCs的总RNA，溶于20 μL DEPC水中，用紫外分光光度计测定A260/280比值(为1.8－2.0)，测定浓度后保存于－70℃。

4.2 逆转录反应 RNA 样品1 μg、100 mg/L Oligo(dT)18.2 μL，加 DEPC 水至 10 μL，80 ℃ 加热变性5 min。取出置冰上，再加入M－MLV逆转录酶200 U、5 × 缓冲液 4 μL、10 mmol/L dNTPmix 2 μL、RNA酶抑制剂20 U，补DEPC水至20 μL，将上面2个步骤的液体混匀，37℃反应1 h;95℃反应3 min。将所有反转录产物置于－20℃ 保存。

4.3 PCR 扩增反应 cDNA 2 μL、Taq 酶 1 μL、dNTP(10 mmol/L)1.5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.6 μL、10×PCR 缓冲液 3 μL、TGF－ β 或 β －actin上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，补三蒸水至 25 μL。PCR反应条件为:预变性94℃ 2 min;94℃45 s、72 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环 20次;72 ℃7 min。用β－actin作为内参照。人TGF－β:上游引物5'－ GCATGGAGTOCTGTGGCAT －3'，下游引物5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGG －3';β －actin上游引物5'－CCGCAAGGACCTCGGCTGGAA －3'，下游引物5'－GATCATGTTGGACAGCGCTC －3'。

4.4 cDNA电泳 所有PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描，软件分析，并计算目的基因/β－actin吸光度(A)的比值。

5 p－ERK蛋白表达水平的测定

用Western blotting方法检测。

5.1 总蛋白提取及浓度测定 用预冷的PBS液轻洗细胞3次后加入2×SDS凝胶加样缓冲液，摇床上摇动15 min，用细胞刮刀刮下细胞残片后将其转移至EP管中，冰上孵育15 min，置于沸水中煮沸约5 min。将蛋白裂解液4℃、12000 r/min离心10 min，上清分装至EP管中，按照BCA法测定蛋白浓度。

5.2 Western blotting 蛋白上样 40 μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白条带转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉 TBS－T溶液(20 mmol/L Tris、137 mmol/L NaCl、0.1%Tween－20)用于封闭和稀释Ⅰ抗，37 ℃封闭3 h后，Ⅰ抗4℃孵育过夜，用1×TBS－T溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室温45 min，1×TBS－T溶液洗膜4×10 min。用ECL试剂检测，感光胶片成像。用凝胶成像系统拍照，用Lab－work软件进行灰度分析。

6 统计学处理

结 果

1 不同浓度prorenin对p－ERK1/2表达的影响

结果表明，prorenin浓度为5×10－10mol/L时，ERK1/2磷酸化与空白对照组比较显著差异。5×10－9mol/L浓度时ERK1/2磷酸化程度最强，见图1。后续实验prorenin浓度均选用5×10－9mol/L。

2 不同时点prorenin刺激对p－ERK1/2表达的影响

结果表明，prorenin能够使 ERK1/2快速磷酸化，最早出现于作用后 5 min，10、20、35 min ERK1/2磷酸化程度逐渐增强，35 min后不再改变。此后对p－ERK1/2观察的时点选取35 min，见图2。

3 PD98059和HRP对p－ERK蛋白表达的影响

结果可见，prorenin可通过激活(P)RR导致信号通道蛋白ERK1/2磷酸化增强，这种作用可被信号通道阻断剂PD98059抑制，但不能被HRP抑制，见图3。

Figure 1.Effect of prorenin at different concentrations on p－ERK1/2 in HRMCs.The bar chart shows the relative density of p－ERK1/2 to ERK1/2..n=3*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(C).图1 不同浓度prorenin对p－ERK1/2表达的影响

Figure 2.The effect of prorenin at different time points on p－ERK in HRMCs.Time course of p－ERK1/2 after addition of human prorenin at 5×10－9mol/L was measured using Western blotting.The bar chart represents the density of p－ERK1/2 to ERK1/2..n=3.#P ＜ 0.01 vs control(C).图2 不同时点prorenin刺激对p－ERK1/2表达的影响

Figure 3.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on p － ERK1/2 in HRMCs.HRMCs were pretreated with the AT1blocker olmsartan(Olm)and the AT2 blocker PD123319 both at 10－5mol/L，and then coincubated with other reagents.Western blotting was preformed.The bar chart shows the relative levels of p－ERK1/2 to ERK1/2 in each group..n=3.##P ＜0.01 vs control.C:control;N:no addition.图3 Prorenin、ERK1/2抑制剂 PD98059和 HRP对 p－ERK蛋白表达的影响

4 PD98059和HRP对TGF－β蛋白表达的影响

结果可见，prorenin可通过激活(P)RR导致TGF－β蛋白表达增高，ERK1/2信号通道阻断剂PD98059能够抑制TGF－β的表达，但HRP不能抑制prorenin上调TGF－β的作用，见图4。

Figure 4.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF － β production in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.The bar chart shows the protein levels of TGF－β evaluated by ELISA in each group..n=4.##P＜0.01 vs control(C).N:no addition.图4 Prorenin、ERK1/2抑制剂PD98059和HRP对TGF－β蛋白表达的影响

5 PD98059和HRP对TGF－β mRNA表达的影响

结果可见，TGF－β mRNA水平与其蛋白水平相一致，即prorenin可通过激活(P)RR导致TGF－β mRNA水平上调，这种作用可被信号通道阻断剂PD98059抑制，但不能被HRP抑制，见图5。

讨 论

高血压肾损伤早期多表现为肾小球肥大、系膜细胞增殖［5］。本研究以不同浓度的prorenin刺激体外培养的HRMCs，发现prorenin使HRMCs的ERK1/2磷酸化增强，且ERK1/2磷酸化程度依赖于prorenin的浓度。有动物实验证实ERK1/2的磷酸化可能参与肾病的发生发展［6］。

Prorenin促进ERK1/2磷酸化理论上有二种途径。其一，HRMCs能够合成血管紧张素原，prorenin与(P)RR结合，发挥蛋白水解酶作用，使血管紧张素原转化成AngⅠ，继而生成AngⅡ，导致ERK1/2磷酸化增强;其二，prorenin激活(P)RR，通过受体直接活化ERK1/2。为确认ERK1/2磷酸化的途径，我们阻断了 AT1和 AT2，以 prorenin干预细胞后，发现ERK1/2磷酸化仍增强，而以ERK1/2信号通道阻断剂PD98059阻断ERK1/2后，p－ERK1/2降低。由此可见，ERK1/2磷酸化是由于(P)RR过度激活的直接效应，而并非依赖于AngⅡ的生成。

Figure 5.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF － β mRNA expression in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.RT－PCR was preformed.The bar chart shows the relative mRNA levels of TGF － β to β － actin in each group.n=1.C:control;N:no addition.图5 Prorenin、ERK1/2抑制剂PD98059和HRP对TGF－β mRNA表达的影响

我们同时观察到:prorenin刺激细胞后，系膜细胞分泌TGF－β增多;而ERK1/2信号通道阻断剂可以阻断该作用，使TGF－β蛋白和mRNA水平下降。这说明TGF－β的调控依赖于ERK1/2信号通路。研究证实TGF－β在各种进行性肾脏纤维化疾病发展中起重要作用，是引起肾小球硬化的主要介质，抑制TGF－β的增高可预防和延缓高血压肾病的发生、发展过程［7］。

HRP是根据prorenin前肽片段氨基酸序列合成的十肽片段。我们发现在体外培养的HRMCs中，HRP并不能阻断 prorenin激活(P)RR所诱导的ERK1/2磷酸化，也不能抑制TGF－β的蛋白表达及mRNA的上调。尽管我们提高HRP的浓度，结果仍然如此。因此我们认为，HRP对体外培养的HRMCs没有(P)RR 的阻断作用。Ichihara 等［8－10］报道，在动物模型中，HRP能够阻断(P)RR，从而延缓肾小球硬化进展，逆转心肌纤维化［11］。但在人平滑肌细胞和单核细胞中，HRP不能阻断(P)RR激活所致的病理作用［12－14］;在高血压鼠模型中，HRP并不影响心肌肥厚和肾损害的进展［15］。有学者认为，HRP在不同的研究中对(P)RR的阻断作用不尽相同是由于动物模型中循环prorenin的水平不一致。由于上述观点的争议，HRP是否是(P)RR的阻断剂尚无定论。

通过上述研究我们发现，在体外培养的HRMCs中，prorenin能够激活(P)RR，使ERK1/2活化，从而导致TGF－β的mRNA表达上调，TGF－β蛋白表达增高，这种机制可能参与并加速肾小球硬化的发展进程。目前临床上应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensinⅡreceptor blocker，ARB)类药物对于改善蛋白尿、肾小球硬化虽有可观的疗效，但长期应用可导致血浆肾素活性(plasma renin activity，PRA)增强，而肾素可不依赖于AngⅡ直接激活(P)RR导致靶器官功能损害加重。因此，目前为止临床用药中无论ACEI、ARB、肾素抑制剂aliskiren或HRP均不能阻断(P)RR过度激活的病理作用，(P)RR仍然是药物作用的盲区。期待将来会出现有效的(P)RR阻断剂，能在RAS系统上游更有效地阻断RAS系统的病理作用，对伴有RAS系统过度激活的心、肾及血管疾病带来更多的获益。

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