内质网应激诱导的细胞凋亡在大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤中的作用及牛磺酸的影响*

成兰云， 门秀丽， 张连元， 李宏杰， 孔小燕， 赵利军

(华北煤炭医学院病理生理学教研室，河北 唐山 063000)

近年来，有越来越多的证据表明:内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在缺血再灌注诱导的细胞功能障碍中起重要的作用［1］。但多数研究集中在对脑缺血的研究［2－4］。目前关于ERS在肢体缺血再灌注(limbs ischemia reperfusion，LIR)后肺损伤中作用的研究很少。内质网(endoplasmic reticulum，ER)对氧化应激非常敏感，并能触发细胞凋亡通路［5，6］。在 ERS反应中，ERS相关蛋白双链 RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(PRK－like ER associated kinase，PERK)、肌醇需要酶1α (inositol requiring protein 1 －alpha，IRE1α)、活化的转录因子 4(ATF4 activating transcription factor 4，ATF4)、X－盒结合蛋白－1(X－box binding protein 1，XBP1)和活化的转录因子 6(activating transcription factor 6，ATF6)表达上调，其中ATF4和XBP1具有细胞保护作用。但当ERS持续存在或过强时，ATF4和XBP1则诱导CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表达，并促进细胞凋亡的发生。

CHOP又称生长停滞及DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153)，属于转录因子 C/EBP家族，它与其它C/EBPs形成异二聚体［7］。CHOP能诱导应激反应，特别是ERS反应，并参与ERS诱导的细胞凋亡途径［8］。牛磺酸是一种内源性氨基酸，它可以在一定程度上调节细胞钙稳态，还有抗炎、抗氧化作用，它是一个很好的细胞保护剂［9，10］。我们以前的研究发现牛磺酸可以保护LIR后的肺损伤，但具体机制尚还不清楚［11］。本研究旨在探讨ERS诱导的细胞凋亡在大鼠LIR后肺损伤中的作用及牛磺酸的影响。

材料和方法

1 LIR诱导肺损伤模型的建立

采用我们已成功建立的模型复制大鼠LIR损伤模型［11］，乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部，阻断血流4 h后松开，恢复血流灌注4 h后分别自颈总动脉放血处死动物，按常规方法采集标本。

2 动物分组

将大鼠随机分成4组，每组10只。(1)对照组(control):常规饲养，双后肢松弛环绕橡皮带，不阻断血流，其余操作同LIR组，这些大鼠未接受预处理，也未受到损伤;(2)LIR组:大鼠经过4 h缺血后，回复血流灌注4 h，未给予预处理;(3)牛磺酸预处理组(LIR+taurine):大鼠在再灌注前30 min时，尾静脉注入牛磺酸200 mg/kg(4%的牛磺酸溶解于0.9%生理盐水中)，其余操作同LIR组;(4)LIR+生理盐水(LIR+saline):大鼠在再灌注前30 min由尾静脉给予相应剂量的无牛磺酸药物溶剂(0.9%生理盐水)处理，其余操作同LIR组。

3 生化指标的测定

将聚乙烯导管(外径0.8 mm)插入颈总动脉，并用无菌塑料注射器收集血样。收集完成后立即封闭注射器，避免与外界空气交换。用血液气体分析仪测动脉血CO2分压(partial pressure of carbon dioxide in artery，PaCO2)和动脉血O2分压(partial pressure of oxygen in artery，PaO2)。

取右肺组织400 mg制备组织匀浆，采用试剂盒(南京建成生物制品公司)测其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。Lowry法测定蛋白含量［13］。

4 Western blotting方法检测各组肺组织CHOP蛋白的表达

取液氮冻存的各组大鼠肺组织各200 mg，加入0.5 mL的组织蛋白裂解液，其主要成分为(mmol/L):β－磷酸甘油20，苯甲酰胺10，焦磷酸钠50，NaF 50，NaC 150，EDTA 5，EGTA 5，Na3VO40.2，Hepes(pH 7.4)，0.1%Triton X －100，PMSF 0.5，aprotinin 0.1，leupeptin 0.02，0.03% β－巯基乙醇。匀浆器将组织研碎，取出匀浆液4℃ 15000 r/min离心20 min。取上清液，按Bradford法测量蛋白浓度。取100 μg样本，于100℃水浴3 min后上样进行SDSPAGE电泳。电泳结束后，湿转移法将蛋白条带转移至PVDF膜上(Millipore)，50 g/L脱脂奶粉封闭后，分别加入CHOPⅠ抗(Santa Cruz)(1∶500)和β－actinⅠ抗(Santa Cruz)(1∶500)置4℃冰箱振荡孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的Ⅱ抗(1∶20000)室温反应1 h。TBST洗涤后，ECL化学发光试剂于暗室中显影，X光胶片曝光，拍照。

5 TUNEL法检测肺组织细胞凋亡

采用罗氏公司的TUNEL法凋亡检测试剂盒对原位细胞凋亡进行检测，检测过程按照试剂盒说明进行。光学显微镜下观察结果并拍照。

6 实时定量PCR(real－time PCR)方法分析内质网应激相关基因的表达

依RNA提取试剂盒(RNeasyMini Kit，Qiagen)说明书，进行RNA提取。取RNA样品2 μg，按RNA逆转录试剂盒 (Omniscript Reverse Transcriptase，Qiagen)说明书，配制反应混合液，PCR仪上37℃反应60 min，反应产物－20℃保存备用。

实时定量PCR，取0.5 μL cDNA作为模板，基因引物序列、退火温度和产物长度见表1。

表1 实时定量的引物序列、退火温度及产物长度Table 1.Primer sequences，annealing temperatures and product length of real－time PCR

按实时定量PCR试剂盒 (real－time PCR MasterMix，Toyobo)说明书在冰上准备 50 μL PCR扩增反应体系:SYBR green I 25 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，双蒸水 23.5 μL。在 ABI 7300 PCR仪上反应，条件:95℃预变性 1 min，95℃ 15 s，60℃(或55℃ )30 s，72℃ 30 s，40个循环。反应结束后，确认real－time PCR的扩增曲线和融解曲线，得到每个样本的Ct值。β－actin作为内参照，利用 2－ΔΔCt公式计算 XBP －1、ATF4 和 CHOP mRNA 的表达情况。

7 组织形态学观察

每组动物任取2只，实验结束时，取左上肺迅速浸入10%甲醛溶液中固定，经二甲苯处理、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜观察并摄片。

8 统计学处理

结 果

1 牛磺酸对PaO2和PaCO2的影响

各组间动物血PaO2和PaCO2差异显著。与对照组相比，LIR组的PaO2和PaCO2明显下降(P＜0.05)，牛磺酸处理组 PaO2明显高于LIR组(P＜0.05)，PaCO2也略有升高但无显著差异(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.The changes of PaO2and PaCO2in different groups..n=10.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LIR group.图1 各组动物PaO2和PaCO2的变化

2 牛磺酸对肺组织中SOD、CAT和MDA的影响

大鼠肢体缺血再灌注4 h后，肺组织中MDA水平明显升高(P＜0.01)，牛磺酸预处理后降低了MDA水平;LIR组与对照组相比，SOD和CAT活性明显降低(P＜0.01，P＜0.05)，而牛磺酸预处理可明显提高肺组织SOD和CAT活性，见表2。

表2 各组动物肺组织SOD、CAT和MDA含量Table 2.The contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(.n=10)

表2 各组动物肺组织SOD、CAT和MDA含量Table 2.The contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(.n=10)

#P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs LIR group.

Group SOD(103U/g protein)CAT(103U/g protein)MDA(μmol/g protein)Control 1.85 ±0.25 1.92 ±0.41 101.0 ±17.3 LIR 0.69 ±0.17# 1.13 ±0.35# 151.0 ±19.4#LIR+saline 0.73 ±0.19# 1.21 ±0.28# 143.0 ±11.2#LIR+taurine1.87 ±0.49* 2.05 ±0.46* 122.0 ±12.8*

3 各组肺组织CHOP蛋白的表达

Western blotting结果显示:与对照组相比，LIR组与生理盐水预处理组肺组织CHOP蛋白表达上调，而牛磺酸预处理可降低肺组织中CHOP蛋白的表达，见图2。

Figure 2.The expression of CHOP protein in ling tissues of rats in various groups detected by Western blotting..n=3.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LIR group.图2 Western blotting方法检测各组动物肺组织中CHOP蛋白的表达

4 各组肺组织内质网应激相关蛋白mRNA的表达

实时定量PCR分析结果表明:与对照组相比，LIR组肺组织中的XBP－1、ATF4和CHOP mRNA表达水平明显上调(P＜0.05)，与LIR组和LIR+saline组相比，牛磺酸预处理能明显抑制缺血再灌注后肺组织中XBP－1、ATF4和CHOP mRNA的表达(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.Real－time PCR was conducted to detect the expression of ATF4，XBP1 and CHOP mRNA of lung tissues in different groups..n=3.#P＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs LIR group.图3 实时定量 PCR检测各组动物肺组织ATF4、XBP1和CHOP mRNA的表达

5 各组大鼠肺组织中的细胞凋亡情况

TUNEL染色结果显示:LIR组和LIR+saline组肺组织阳性细胞增多，凋亡细胞核呈棕黄色，而对照组肺组织未见明显细胞凋亡现象，牛磺酸处理组肺组织凋亡细胞数明显减少。牛磺酸这种保护作用与内质网应激相关基因CHOP及ATF4和XBP－1的表达下调一致，见图4。

6 肺组织形态学变化

与对照组比较，LIR组动物肺组织水肿，肺泡隔增宽，毛细血管扩张充血，血管床中有大量炎症细胞聚集、附壁，部分动物肺泡腔中可见到出血和蛋白渗出物;而牛磺酸处理组，肺泡隔轻度增宽，肺泡腔中蛋白渗出物明显减少，见图5。

Figure 4.Effect of taurine on apoptosis in lung tissues of rats in various groups(TUNEL，×200).A:control group;B:LIR group;C:LIR+saline group;D:LIR+taurine group.图4 TUNEL法检测各组肺组织中细胞凋亡情况

Figure 5.Histological changes in lung tissues from different groups(HE，×100).A:control group;B:LIR group;C:LIR+taurine group.图5 各组动物肺组织光镜下改变

讨 论

越来越多的证据表明缺血再灌注可引起ERS反应，而且ERS介导的细胞凋亡参与了很多疾病的发生，如糖尿病和缺血再灌注损伤等［12－14］。内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞钙离子储存的场所，对细胞应激反应起调节作用。ERS可由多种原因引起，如缺氧、钙离子平衡失调及自由基侵袭等。我们以前的研究表明LIR后的急性肺损伤与氧化应激有密切关系［11］。而肺组织细胞可分泌大量蛋白质，具有较丰富的内质网，因此我们推测，这些细胞的损伤可能与强烈的ERS反应有关，但有关LIR后肺损伤与ERS介导细胞凋亡的关系尚未见报道。

CHOP是一个b－Zip转录因子，属于CCAAT增强子连接蛋白的转录因子C/EBP家族。正常情况下，CHOP表达非常低;在ERS时，通过以下机制上调CHOP表达:(l)内质网跨膜蛋白IRE和ATF6活化［13］，其胞浆活性部分(XBP1和ATF6)进入核内，与ERS反应元件序列中的CCAAT－N9－CCACG相连，然后启动CHOP转录与表达［14］;(2)通过PERK－eIF2a途径活化，导致转录子ATF4和ATF3表达，ATF4结合氨基酸调控元件，再诱导 CHOP表达。CHOP可能通过下调Bcl－2表达、耗竭谷胱甘肽等，活化 caspase－3，最终导致细胞凋亡［15］。

我们已经报道了牛磺酸对LIR后肺组织细胞凋亡有保护作用［11］。其保护作用与其抗氧化效应有关。但牛磺酸对LIR后ERS诱导细胞凋亡的影响尚未见报道。

本研究中，TUNEL染色结果表明，与LIR组相比较，牛磺酸预处理组大鼠肺组织的细胞凋亡明显减少，PaO2升高，肺组织中的MDA水平明显降低，并且光镜下结果也显示肺损伤减轻。SOD和CAT在LIR组大鼠肺组织中明显减少，牛磺酸处理组这些抗氧化酶活性增加，因此，认为牛磺酸的保护作用与其抗氧化密切相关。

为了进一步探讨牛磺酸对大鼠LIR肺损伤时内质网应激诱导细胞凋亡的影响，我们研究了ERS相关基因XBP－1、ATF4和CHOP的表达情况。实时定量PCR结果表明:大鼠 LIR后肺组织中ATF4、XBP－1和CHOP mRNA表达上调，而牛磺酸预处理可使这些基因的表达下调。Western blotting结果也表明:牛磺酸能降低LIR后肺组织CHOP蛋白的表达，并且此时肺组织细胞凋亡减少，氧化应激水平降低，肺呼吸功能改善。这些结果提示牛磺酸对LIR后肺组织的保护作用与减轻ERS反应有关。而且我们以前的研究发现:LIR后肺组织B细胞淋巴瘤/白血病 －2(B cell lymphoma/leukemia－2 Bcl－2)表达下调，Bcl－2 相关 X 蛋白(Bax)表达上调［16］，本次实验结果也提示牛磺酸可抑制bax基因表达的上调(结果未在文中显示)。我们推测牛磺酸减少细胞凋亡的发生还可能与减轻ERS反应，从而抑制某些促凋亡基因的表达有关。

总之，本研究表明，牛磺酸可通过抑制氧化应激反应减轻ERS诱导的细胞凋亡，其机制与牛磺酸下调LIR后肺组织ATF4和XBP－1的表达，降低促凋亡转录因子CHOP的水平有关，但具体机制有待进一步研究。

［1］DeGracia DJ，Montie HL.Cerebral ischemia and the unfolded protein response［J］.J Neurochem，2004，91(1):1－8.

［2］Hayashi T，Saito A，Okuno S，et al.Oxidative injury to the endoplasmic reticulum in mouse brains after transient focal ischemia［J］.Neurobiol Dis，2004，15(2):229 －239.

［3］Hayashi T，Saito A，Okuno S，et al.Damage to the endoplasmic reticulum and activation of apoptotic machinery byoxidative stress in ischemic neurons［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(1):41 －53.

［4］Benavides A，Pastor D，Santos P，et al.CHOP plays a pivotal role in the astrocyte death induced by oxygen and glucose deprivation［J］.Glia，2005，52(4):261 －275.

［5］Szabadkai G，Rizzuto R.Participation of endoplasmic reticulum and mitochondrial calcium handling in apoptosis:more than just neighborhood?［J］.FEBS Lett，2004，567(1):111－115.

［6］Xu C，Bailly－Maitre B，Reed JC.Endoplasmic reticulum stress:cell life and death decisions［J］.J Clin Invest，2005，115(10):2656－2664.

［7］Ron D，Habener JF.CHOP，a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant－negative inhibitor of gene transcription［J］.Genes Dev，1992，6(3):439－453.

［8］Zinszner H，Kuroda M，Wang X，et al.CHOP is implicated in programmed cell death in response to impaired function of the endoplasmic reticulum［J］.Genes Dev，1998，12(7):982－995.

［9］Guz G，Oz E，Lortlar N，et al.The effect of taurine on renal ischemia － reperfusion injury［J］.Amino Acids，2007，32(3):405－411.

［10］黎承杨，邓耀良，孙丙华，等.牛磺酸对大鼠草酸钙结石肾脏的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2009，25(4):738－743.

［11］门秀丽，张连元，董淑云，等.牛磺酸对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤时细胞凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2004，20(3):421 －424.

［12］Oyadomari S，Koizumi A，Takeda K，et al.Targeted disruption of the Chop gene delays endoplasmic reticulum stress－ mediated diabetes［J］.J Clin Invest，2002，109(4):525－532.

［13］Jousse C，Bruhat A，Carraro V，et al.Inhibition of CHOP translation by a peptide encoded by an open reading frame localized in the chop 5'UTR ［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(21):4341 －4351.

［14］Ma Y，Brewer JW，Diehi JA，et al.Two distinct stress signaling pathways converge upon the CHOP promoter during the mammalian unfolded protein response［J］.J Mol Biol，2002，318(5):1351 －1365.

［15］Ito Y，Pandey P，Mishra N，et al.Targeting of the Abl tyrosine kinase to mitochondria in endoplasmic reticulum stress － induced apoptosis［J］.Mol Cell Biol，2001，21(18):6233－6242.

［16］门秀丽，张连元，杨全会，等.大鼠肢体缺血再灌注后肺组织 bax基因表达上调［J］.基础医学与临床，2005，25(3):261－264.