内毒素急性肺损伤中p38MAPK、NF－κB与HO－1的关系

詹丽英， 李文澜△， 柯 伟， 夏中元

(1武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060;2湖北省中山医院神经内科，湖北 武汉 430033)

内毒素存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为其主要成份。内毒素所致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床上常见的急危重综合征，很多疾病可并发内毒素性ALI。ALI作为全身炎症反应病理进程中的早期阶段，常发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiartory distress syndrome，ARDS)，是创伤、休克、外科感染等疾病致死的主要原因之一［1］。本研究将选用气管内滴注内毒素急性肺损伤模型，探讨在 ALI中p38MAPK、NF－κB与HO－1的相互关系，为临床治疗提供理论依据。

材料和方法

1 材料

LPS、4－(4－氟苯基)－2－(4－甲基亚磺酰基苯基)－5－(4－吡啶基)－1H－咪唑(SB203580，p38MAPK抑制剂，Sigma)、锌原卟啉 IX(ZnPPIX，血红素氧合酶 －1抑制剂，Sigma)，血晶素(Hemin，血红素氧合酶 －1诱导剂，Sigma)，BCA检测试剂盒(Pierce)，兔抗大鼠MAPK(p38)抗体(BD)，兔抗大鼠NF－κB(p65)抗体(NeoMarkers)，anti－β－actin抗体(Santa Cruz)，羊抗兔HRP－IgG(eBioscience)。

健康雄性Wistar大鼠40只，体重200－250 g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 实验动物模型的制备及分组

实验前禁食12 h，自由饮水。大鼠用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定消毒后逐层暴露气管，动脉穿刺针(24号)经环甲膜向心端刺入气管，LPS组用1 mL注射器抽取无菌生理盐水配制的LPS溶液2.5 mg/kg连接穿刺针，回抽见空气无阻力后将药液缓慢滴入气管中，拔出穿刺针，将大鼠直立旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合切口后观察。

动物分组:(1)对照组或生理盐水组(NS组):气管内给予等容积生理盐水;(2)内毒素组(LPS组):气管内滴注LPS 2.5 mg/kg;(3)血红素氧合酶－1诱导剂血晶素+内毒素组(Hemin+LPS组):在气管内滴注LPS前18 h腹腔注射Hemin 75 μmol/kg;(4)血红素氧合酶－1抑制剂锌原卟啉IX+内毒素组(Zn-PPIX+LPS组):在气管内滴注LPS前18 h腹腔内注射ZnPPIX 40μmol/kg;(5)p38MAPK抑制剂SB203580+内毒素组(SB+LPS组):在气管内滴注LPS前2 h SB203580以5 μmol/kg 2 h持续股静脉泵入。

2.2 标本的采集及处理 LPS或NS滴注后6 h，颈动脉抽血2 mL，其中1 mL立即行血气分析。之后颈动脉放血处死动物，开胸后结扎右侧肺门，气管切开，插入0.2 cm硅胶管，用4℃生理盐水2 mL反复灌洗右肺2次，记录灌洗液回收量，每次回收量无明显差异，离心(3000 r/min)10 min，取上清液－70℃保存;测量右肺上叶湿/干重比;取右肺下叶肺组织行p38MAPK、NF－κB蛋白检测;取右肺中叶行免疫组化染色和HE染色。

2.3 检测指标及方法

①支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中性粒细胞(neutrophil)比 取BALF液沉淀，制细胞悬液少量于玻片，瑞氏－姬姆萨染色，油镜下数200个细胞，得出多形核白细胞、分类计数，计算中性粒细胞百分比。

②BALF中蛋白含量 考马斯亮蓝蛋白测定法测BALF中蛋白含量。

③ 肺湿/干重比(wet/dry weight ratio，W/D) 取右肺上叶，滤纸吸干表面附着水分，用分析天平准确测量肺组织湿重，并记录，于80℃恒温箱烤72 h至肺干重恒定，称其湿、干重，计算肺湿/干重(W/D)比值。

④动脉血气(arterial blood gas，ABG) 按要求将血液填充到i－STAT手提式血气分析仪配套的血气分析测试片(i－STAT EG7+cartridge)加样池中，避免气泡产生，将标本插入自动血气分析仪，读取动脉氧分压(arterial oxygen pressure，PaO2)、动脉血二氧化碳分压(partial pressure of carbon dioxide in artery，PaCO2)和碳酸氢根(bicarbonate radical，HCO－3)值。⑤Western blotting法检测肺组织p38MAPK、NF－κB蛋白表达 开胸取出右下肺组织，低温保存，将肺组织标本用PBS洗涤2次后，加入裂解缓冲液，冰浴内匀浆，4℃ 12000 r/min离心30 min以除去组织碎片。取上清，用BCA检测试剂盒检测总蛋白浓度。取50 μg蛋白溶于2×SDS上样缓冲液中，将样本100℃煮沸5 min后，将上述各样品经质量浓度10%SDS－PAGE凝胶，转移至PVDF膜，用质量浓度5%脱脂奶粉室温封闭 1 h后，将 PVDF膜与Ⅰ抗(p38MAPK抗体，β－actin抗体)孵育，用TBST洗3次后将膜与HRP标记Ⅱ抗孵育1 h。TBST漂洗后，ECL显色，X片曝光，照相。使用凝胶成像分析系统对显色条带进行吸光度分析。以样本的平均吸光度除以相应内参照的平均吸光度，即为样本蛋白的相对含量，然后将各样本蛋白的相对含量间做统计分析图。

⑥HO－1蛋白表达 开胸取出右肺中叶组织，体积分数10%多聚甲醛固定，常规脱水石蜡包埋，制备3 μm厚的切片。SP法免疫组化染色按操作说明实施。阳性结果判断:以肺组织切片细胞胞浆中出现棕黄色颗粒状沉淀物为阳性细胞。将切片置Olympus显微镜(400倍)下，对所测视野进行准确定位，由摄像系统提取数值化细胞图像，输入HPIAS－2000高清晰度彩色病理图像分析系统(同济千屏影像公司)进行处理，每标本随机选取8个不重叠的视野，测定免疫组化阳性颗粒的平均光密度值，并计算8个视野吸光度值的均值，对HO－1蛋白表达做半定量分析。

⑦病理观察 开胸取出右肺中叶0.5 cm×0.5 cm组织行光镜观察。

3 统计学处理

结 果

1 肺组织湿/干重比、支气管肺泡灌洗液中细胞计数比及蛋白含量

与NS组比较，LPS组、Hemin+LPS组、SB+LPS组、ZnPPIX+LPS组肺组织湿/干重明显增加(P＜0.05)，中性粒细胞比、蛋白含量显著增加(P＜0.05或P＜0.01);与LPS组比较，Hemin+LPS组、SB+LPS组肺组织湿/干重、中性粒细胞比、蛋白含量明显减少(P＜0.05)，而ZnPPIX+LPS组显著增加(P＜0.05);Hemin+LPS组、SB+LPS组之间无显著差异(P ＞0.05)，见表1。表1 肺组织湿/干重比、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞比及蛋白含量

Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)

Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.

2 动脉血气

滴注LPS 6 h后，PaO2、PaCO2和HCO－3较NS组显著下降(P＜0.05)。Hemin+LPS组、SB+LPS组PaO2、PaCO2和HCO－3明显高于LPS组，而ZnPPIX+LPS组明显下降(P＜0.05)，Hemin+LPS组、SB+LPS组之间无显著差异(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.Results of arterial blood gas analysis..n=8.△P＜0.05 vs NS group;▲P＜0.05 vs LPS group.图1 动脉血气结果

3 肺组织p38MAPK、NF－κB蛋白表达

与NS组比较，LPS组、Hemin+LPS组、SB+LPS组、ZnPPIX+LPS组p38MAPK、NF－κB蛋白表达明显增高(P＜0.05);与LPS组比较，Hemin+LPS组、SB+LPS组的p38MAPK、NF－κB蛋白表达显著降低(P ＜0.05)，ZnPPIX+LPS组 p38MAPK、NF－κB蛋白表达明显增高(P＜0.05);Hemin+LPS组、SB+LPS组的p38MAPK、NF－κB蛋白表达无显著差异(P ＞0.05)，见图2、3。

4 肺组织HO－1表达

NS组HO－1免疫组化染色，基本未见阳性表达细胞;与NS组比较，LPS组肺组织HO－1强阳性表达(P＜0.01)，HO－1主要表达部位在支气管、肺泡上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，见图4A－E;与LPS组相比，Hemin+LPS组、SB+LPS组HO－1的表达明显升高(P＜0.05)，ZnPPIX+LPS组HO－1的表达明显降低(P＜0.05)，Hemin+LPS组、SB+LPS组之间无显著差异(P＞0.05)，见图5。

Figure 2.Expression of p38MAPK in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P＜0.01vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.图2 肺组织中p38MAPK表达

Figure 3.Expression of NF－κB in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.图3 肺组织中NF－κB的表达

Figure 4.HO －1 immunohistochemistry staining of lung tissue(×400).A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.图4 大鼠肺组织HO－1免疫组化

Figure 5.Expression of HO－1 in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.图5 肺组织HO－1表达

5 肺组织形态学

(1)NS组:肺组织肺泡结构清晰，肺泡壁薄，未见出血水肿等明显炎症病理改变(HE×400)。(2)LPS组:肺泡腔变窄，肺泡壁增厚;肺间质充血、水肿、炎症细胞浸润，肺泡腔内可见粒细胞明显增多，并见局部肺气肿。(3)Hemin+LPS组:肺间隔炎症细胞浸润较LPS组明显减轻，毛细血管增生不明显。(4)ZnPPIX+LPS组:肺泡腔明显变窄，肺间质明显充血、水肿，大量炎症细胞浸润。(5)SB+LPS组:支气管壁周围稍有增厚，肺泡大小形态稍不规则，损伤程度亦明显小于LPS组，见图6A－E。

Figure 6.HE staining of lung tissue.A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.图6 大鼠肺组织HE染色

讨 论

ALI/ARDS是一种常见的灾难性临床综合征，自1967年Ashbaugh等［2］报道以来，该病的流行病学、发病机制及治疗策略等方面有重要的进展，但缺乏有效的治疗方法，病死率仍居高不下(40% －60%)［3］。目前ALI/ARDS的治疗方法主要是支持治疗和抗炎治疗，疗效不明显，关键是其发生机制尚不很清楚。

本研究采用气管内滴入LPS复制大鼠ALI模型［4］，滴入 LPS后 6 h，LPS 组动物肺组织出现典型的ALI变化:动脉氧分压显著下降，肺湿/干重比、BALF中蛋白浓度、中性粒细胞比明显增加，与正常对照组相比，上述各项指标均有显著差异，说明本实验的动物模型是成功的。

ALI的本质是一种炎症［5］，在细胞水平上表现为单核巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞的浸润;在分子水平则表现为黏附因子的过度表达及多种炎症介质的产生。

NF－κB是一类能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质，是ALI炎症反应的主要炎症介质和转录因子［6］，在细胞因子瀑布效应中发挥着开关作用。NF－κB的持续活化与肺损伤的严重程度有关，在ALI的炎症介质网络调控中起中心环节作用［7］，阻断NF－κB途径对即使已发生的肺部炎症是有利的［8］。

MAPK是信号由细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，在控制炎症反应中具有重要作用［9］，它的持续激活引起炎症细胞因子的不断产生，导致级联“瀑布”效应。

目前认为，MAPK信号通路中与激活NF－κB关系最为密切的是p38MAPK，它是激活NF－κB的主角。用牛磺胆酸钠诱导急性胰腺炎模型鼠发现，巨噬细胞p38MAPK活性增强，同时伴有NF－κB的激活［10］，因此抑制p38MAPK的表达可以抑制NF－κB活性。p38MAPK信号通路在介导细胞对LPS的激活反应中发挥着重要作用，它的磷酸化导致一系列的PMN 的前炎症效应［11］，活化的 p38MAPK、NF－κB能以极快的速率磷酸化，引起呼吸爆发，释放大量氧自由基，导致细胞损伤［12］，同时在转录水平诱导iNOS和COX2等细胞因子的基因表达［13］，导致失控性炎症反应。p38MAPK抑制剂能降低肺毛细血管通透性，改善肺病理学损害，完全预防急性胰腺炎相关的肺损伤［14］。近年来，通过抑制p38MAPK减轻ALI提示p38MAPK抑制剂具有一定的应用前景［15，16］。

血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)是血红素分解的关键酶和限速酶，现已证明HO有3种异构体，其中HO－1是一种应急反应性蛋白，作用广泛，具有抑制细胞凋亡和抗炎作用;其降解产物胆红素、胆绿素及一氧化碳(CO)可能在这方面起着重要作用。胆红素、胆绿素能减轻白细胞与血管内皮细胞的黏附，抑制NADPH氧化酶的激活［17］、抑制单核细胞的趋化;胆红素还有抗补体特性，保护细胞免遭补体活化介导的炎症损伤。

本研究发现，在使用HO－1诱导剂Hemin和p38MAPK抑制剂SB203580后HO－1显著升高，p38MAPK、NF－κB蛋白表达明显下降;而在使用HO－1抑制ZnPPIX后HO－1显著下降，比LPS组更低，p38MAPK、NF－κB明显升高，较LPS组更高，说明HO－1活性增高抑制了p38MAPK、NF－κB的表达，反之亦然，HO－1与p38MAPK、NF－κB是相互抑制的。这与姚 琳等［13］、Ryter等［18］提到的 p38MAPK 和NF－κB处于iNOS和HO－1的上游相反。

总之，在ALI中HO－1与p38MAPK/NF－κB是两条独立的信号转导途径，从而为临床治疗ALI提供新的思路。

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