牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用*

刘合义,余丽芸,侯喜林,孙留霞,周玉龙,王进轶,刘双翼,朴范泽

牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用*

刘合义,余丽芸,侯喜林,孙留霞,周玉龙,王进轶,刘双翼,朴范泽

目的获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒M ebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测;用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测。结果BCV-DQ株N基因全长1 347bp,与GenBank已发表的6株BCV的N基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上。构建的重组质粒pET-N能表达出一条大小约为60 ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应。用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%。结论BCV N基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性。临床检测结果表明N蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。

牛冠状病毒;N基因;克隆;序列分析;原核表达

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是冠状病毒科冠状病毒属成员,为不分节段的单股正链RNA病毒,是引起犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病的主要病原〔1〕。冠状病毒属成员分为4个抗原群:第1群包括人冠状病毒HCV-229E、猪传染性胃肠炎病毒、犬冠状病毒等;第2群包括BCV、猪血凝性脑脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、人冠状病毒HCoV-OC43等;第3群成员有传染性支气管炎病毒等;第 4群为SARS冠状病毒〔2-3〕。BCV基因组大小约32 kb,编码5种主要结构蛋白,即纤突蛋白(S)、核蛋白(N)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(E)和血凝素酯酶蛋白(HE)〔4〕。其中核衣壳蛋白基因(N)是BCV主要结构蛋白基因,与基因组RNA组装成核糖核蛋白复合物〔5〕。N蛋白不仅在病毒致病性、转录和翻译及增强细胞免疫等方面也起到重要作用,而且具有辅助增强病毒 RNA复制的能力〔6-7〕。N基因高度保守,可作为诊断BCV的候选基因〔8〕。

本研究欲对BCV-DQ株N基因进行克隆和序列分析,同时对N基因进行原核表达和纯化,获得具有特异性的诊断抗原,建立ELISA方法并对临床标本进行初步检测。

1 材料和方法

1.1 病毒、细胞、菌株和质粒 BCV-DQ株、表达载体pET-30a(+)、宿主菌 DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。HRT-18(人直肠癌细胞)购自中科院上海细胞库。

1.2 试剂 pMD18-T载体、TaqDNA聚合酶、dNTP、RNA 酶抑制剂、M-MLV、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ等购自Fermentas公司;Trizol Reagent购自 Invitrogen 公司 ;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公产品;羊抗鼠IgG-HRP购自Sigma公司;DAB购自AMRESCO公司;其他试剂均为分析纯试剂。

1.3 试验动物 BALB/c小鼠由长春实验动物中心提供。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank中已发表的BCV U00735 Mebus株 N基因全序列,利用DNAStar和Prime 5.0设计1对引物,在上游引物中引入BamHⅠ限制性内切酶位点,在下游引物中引入XhoⅠ限制性内切酶位点(酶切位点用斜体加粗标记),预计扩增片断为1 347 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下:

1.5 病毒RNA的提取 用 Trizol试剂提取病毒总 RNA 。取细胞病毒液约 200 μ L,加入 600 μ L Trizol,振荡 30 s,静置 2～ 3 min;加入氯仿 200 μ L,静置待其分层,然后12 000 r/min离心15 min;这时液体分成3层,最上层为 RNA层,中间为蛋白层,最下层为DNA层,小心吸取 RNA层,移入另一离心管中;500 μ L异丙醇加入含有RNA的离心管中混匀,静置10 min,12 000 r/min离心 10 min,小心吸弃液体;向沉淀加入75%乙醇1 mL,混悬沉淀,然后7 500 r/min离心5 min;吸弃乙醇,放入真空干燥机5 min,使管内残留的乙醇挥发,但要避免过分干燥 RNA;加入20 μ L无 RNA酶的去离子水溶解核酸,-70℃保存或直接做反转录。

1.6 目的基因的扩增、克隆及序列分析

1.6.1 反转录合成 cDNA 吸取5 μ L提取的RNA样品溶液放于离心管中,加入3 μ L下游引物,3 μ L 无 Rnase 水,70℃预热5 min,冰浴5 min,依次加入 4μ L 5 ×反转 录缓 冲液 、3 μ L 10mmol/L dNTPs 、1μ L Rnasin(40U/μ L)、1μ L M-MLV,总体积 20 μ L,42℃温浴 1h 。

1.6.2 PCR扩增反应体系(25 μ L) 10×PCR Buffer缓冲液 2.5 μ L,dNTP 2 μ L,上下游引物各 1 μ L,Taq DNA 聚合酶 0.5μ L,模板 2 μ L,加水至 25 μ L。同时设阴性对照。循环参数为:94℃5min,94℃1 min,58℃1min30s,72℃2 min,共35个循环,最后72℃延伸10 min。

1.6.3 N基因克隆及序列分析 将PCR产物纯化回收,并与pMD18-T载体连接,转化DH5α感受态细胞,用含Amp+的 LB琼脂平板筛选,提取质粒,酶切鉴定重组质粒,阳性克隆命名为pMD-N,送上海生工测序。对测序结果用DNAstar软件进行序列分析。

1.7 重组原核表达载体的构建 用BamHⅠ和XhoⅠ从pMD-N质粒上双酶切下目的基因片断,纯化回收后与同样双酶切的pET-30a(+)载体相连,转化入BL21感受态细胞,用含卡那霉素的LB琼脂平板筛选,挑取单个白色菌落于37℃过夜培养后抽提质粒,经酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为pET-N。

1.8 重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE凝胶电泳〔9〕将 pET-N阳性质粒转化至 BL21(DE3)中,挑取单个菌落接种含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中,于37℃振荡培养至OD600nm为0.6～1.0时,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达目的蛋白,并分别在3 h、4 h和5 h时取1.0 ml菌液,同时收集未诱导的菌液作为阴性对照,对经转化BL21的空载体也以相同的条件诱导,作为对照。于12%SDS-PAGE分离胶上进行电泳分析。

1.9 表达蛋白的回收与纯化 参照分子克隆实验指南〔10〕,利用电洗脱的方法纯化蛋白。

1.10 制备鼠抗BCV阳性血清 取经过蔗糖密度离心纯化的BCV病毒液1 mL与等量弗氏完全佐剂混合,制成乳化剂。第1次免疫给BALB/c健康小鼠腹腔注射乳化剂(0.3mL/只),然后每隔2周用不完全弗氏佐剂加强免疫1次,免疫剂量、途径与第一次相同。第3次免疫后7 d采血、分离血清,置-20℃保存备用。

1.11 重组蛋白的Western blot鉴定 将纯化后的融合蛋白进行 Western blot检测鉴定。将 SDSPAGE蛋白带转移至硝酸纤维素膜,用含5%脱脂奶粉的PBST封闭,以鼠抗BCV血清为一抗,羊抗鼠IgG-HRP为二抗,DAB染色。

1.12 临床初步应用 用纯化的N蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为1.75 μ g/mL,血清最佳稀释倍数为1∶200,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,初步建立了检测牛冠状病毒抗体的间接ELISA方法。对黑龙江省内不同地区共256份牛血清样品进行检测,并与中和试验进行比较,计算其符合率。

2 结 果

2.1 N基因的扩增和克隆 RT-PCR扩增出约1 347bp左右大小的片段,与预测结果一致(图1)。回收扩增产物,克隆到pMD18-T载体中,得到重组质粒pMD-N,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确(图2)。2.2 序列测定与分析 我们将N序列提交Gen-Bank,获得 Accession:FJ556872。用 DNAStar软件分析测序结果,与GenBank上BCV各株之间的同源性比较得出,BCV-DQ株与USA(AF058942株)的同源性在100%,与BCoV-ENT(AF391541)的同源性在98.3%,与参考株Mebus U00735的同源性在99.3%,与Germany(EF193073)株的同源性在 99.2%。与呼吸道分离株 BCoV-LUN(AF391542)株的同源性在98.4%。

将其它冠状病毒N基因序列从GenBank下载后用DNAStar软件进行多重比对,构建出了进化关系树,由图3可见BCV与人冠状病毒OC43及人肠道冠状病毒4408亲缘关系最为接近。

图3 冠状病毒N基因进化关系树Fig.3 Phylogenetic tree of N genes fromdifferent coronavirus.

通过DNAStar Protein程序对推导的N基因氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可能性预测,发现100～111、269～280、390～410和415～429区段显示出很高的亲水性、抗原指数和表面可能性

(如图4)。

图4 N蛋白的亲水性、抗原指数及表面可能性分析Fig.4 Hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot for N protein.

2.3 重组表达质粒的酶切鉴定 将所获得的重组表达质粒pET-N用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,酶切结果与预期大小相符(图5)。

2.4 SDS-PAGE电泳及目的蛋白的回收、纯化结果 N基因表达产物SDS-PAGE电泳后,经染色、脱色,发现含重组质粒的诱导菌在60 ku处出现一条特别粗的蛋白带,大小与融合蛋白的理论值一致,随着诱导时间的增加,其表达量随之增加,在5 h时达到最大值,而未诱导的重组质粒转化菌和空载体质粒转化菌没有出现相同的条带(图6)。用电洗脱方法回收、纯化的蛋白,纯度较高,结果见图7。

2.5 重组蛋白的免疫活性鉴定 经Western blot鉴定(如图8),纯化的表达产物与鼠抗BCV血清发生反应,而未经重组的菌体不发生反应。

图8 重组蛋白的Western blot鉴定Fig.8 Western blot analysis of the expressed product

2.6 临床初步应用 对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品的检测结果(表1)显示阳性样品167份,阳性率65.23%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率达95.31%。

表1 重组N蛋白-ELISA的检测应用Table 1 Application of recombinant N protein based ELISA

3 讨 论

本试验采用RT-PCR技术扩增了BCV-DQ株的N基因全长序列并克隆入pMD18-T载体中,通过鉴定后再亚克隆入pET-30a(+)表达载体中构建了重组表达载体。核苷酸序列测定显示扩增片段长度为1 347 bp,包括完整的N基因开放阅读框,N基因全长为1 347 bp,编码448个氨基酸。核苷酸序列与GenBank所发表的其它BCV序列的同源性可达98.3%以上,氨基酸同源性在98.7%以上,证明N基因的序列非常保守,与 Lapps等〔8〕、Arnold等〔11〕的报道一致。选择表达的 N蛋白建立的ELISA方法可用于BCV临床诊断及血清流行病学调查。

将其它冠状病毒N基因序列从GenBank下载后进行同源性比较,利用DNAStar软件绘制的冠状病毒进化关系树与 2001年国际病毒分类委员会(ICTV)公布的关于BCV的分类群相符合。BCV与人的冠状病毒OC43的同源性最高,表明了BCV存在感染人的可能性。国内外不少研究者从人血清中检测到了BCV抗体,进一步证实了BCV可能感染人〔12-13〕。在临床样品检测中也发现了这一特点,如鼠和大鼠、鸡和火鸡、人和冠状病毒存在宿主转移现象〔14〕。

用DNAStar Protean程序推测、分析N蛋白的亲水性、抗原性和表面可能性,在 100～111、269～280、390～410和 415～429区段的亲水性指数、抗原指数较高,其呈现在蛋白表面的可能性也比较大,推测这几段区域可能是N蛋白的主要抗原位点。

本试验将成功扩增的BCV N基因插入到原核表达载体pET-30a上,在E.coliBL21(DE3)工程菌株内成功进行了表达。Western blot分析结果证明该蛋白具有良好的反应原性。原核表达载体pET-30a可高效稳定表达外源蛋白,并具有表达量高、纯化工序简单、成本低廉的优点,便为临床样本检测制备相应的抗原。用纯化的重组N蛋白对256份送检血清的检测,结果进一步证明,N蛋白可以作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。

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Prokaryotic expression of the nucleocapsid protein gene in bovine coronavirus and its preliminary application

LIU He-yi,YU Li-yun,HOU Xi-lin,SUN Liu-xia,ZHOU Yu-long,WANG Jin-yi,LIU Shuang-yi,PIAO Fan-ze

(Animal Technology College of Heilongjiang August First Land Reclamation University,Daqing163319,China)

To obtain and analyze the sequence of the nucleocapsid gene from bovine coronavirus,and to produce the fusion protein of the N gene inE.coliin order to use this recombinant protein for the study of bovine coronavirus.The N gene of BCV-DQ strain was amplified by RT-PCR,in which the primers were designed on the basis of N gene sequence of BCV-Mebus strain.The PCR products of 1 347 bp in length were cloned and sequenced,and then inserted into the prokaryotic vector pET30a.The recombinant plasmids were then transformed intoEscherichia coliBL21 and identified by SDS-PAGE and Western blot assay.ELISA assay was optimized of N protein as the coating antigen to detect the viruses in the clinical samples.In comparison with 6 BCV strains in GenBank,the sequence identity was proved to be more than 98.3%.Result in SDS-PAGE showed that the fusion protein had a molecular weight of 60 ku,and could be specifically recognized by mouse serum against BCV.The indirect ELISA was used to test 256 serum samples collected from Heilongjiang province and 65.23%samples were positive.On testing field samples,an overall agreement of 95.31%was generated between the the neutralization test of viruses(VN)and indirect ELISA.It is apparent that the N gene was highly conservative and is expressed inE.coliin high level,also the prokaryotic expression products of this gene show a fine reactiongenicity in immune responses.It was also suggested that the N protein may be a useful antigen for sero-diagnosis and epidemiological investigation of BCV.

bovine coronavirus;N gene;cloning;sequence analysis;prokaryotic expression

S852.65

A

1002-2694(2010)01-0076-05

*黑龙江农垦总局攻关课题(HNKXIV-08-07)

侯喜林,Email:xly_hou@yahoo.com.cn

黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319

2009-02-18;

2009-09-09