多聚鸟氨酸海藻酸钡微囊物理性能和生物相容性研究

王健,邱丽媛,张文君,段翠密,郝彤,林秋霞,王常勇

海藻酸微囊包裹同种来源、异种来源的细胞或基因工程化细胞后可以较为有效地截割大分子的免疫活性物质进入微囊内部,避免细胞体内移植后引发的免疫排斥反应;而允许小分子的营养物、分泌物等通过,使被包裹的细胞获得各种营养物质并正常行使其细胞生理功能,在各种疾病或代谢功能失调的治疗上具有广阔的应用前景。如:微囊化异体多巴胺能神经元用于治疗帕金森病[1],微囊化牛肾上腺嗜铬细胞用于移植治疗晚期癌痛[2],微囊化软骨细胞治疗骨软骨缺损性疾病[3];特别是微囊化胰岛细胞用于治疗糖尿病[4],微囊化肝细胞移植治疗肝功能衰竭和某些先天性肝代谢疾病[5-6]的深入研究使得微囊化技术受到越来越多的关注。

二价或多价阳离子是重要的海藻酸微囊制备材料,与海藻酸结合的阳离子的种类直接影响微囊的性能,通常使用最为广泛的是Ca2+。李洪波等报道使用Ba2+替代Ca2+,制备的BPA微囊较之于APA微囊具备更好机械强度和生物相容性[7-8]。另外,多聚氨基酸是另一种重要的海藻酸微囊制备材料,其中以多聚赖氨酸(PLL)使用最为广泛。但也有报道指出,多聚赖氨酸会导致微囊膜黏附成纤维细胞和巨噬细胞,产生多种细胞因子[9],降低微囊的长期稳定性和生存力。根据Marcus等的报道使用多聚鸟氨酸(PLO)制备的APA微囊比多聚赖氨酸制备的APA微囊具有更好的物理性能,更好的生物相容性[10-11]。在此基础之上,我们选用多聚鸟氨酸作为制囊多聚氨基酸,替代传统的多聚赖氨酸,优化制囊条件,制备出海藻酸钡-多聚鸟氨酸-海藻酸(Ba-alginate-Poly-L-Ornithine-Alginate microcapsules,B-PLO-A)微囊,对 PLO-和 PLL-包被的海藻酸钡微囊的物理性能和生物相容性进行了对比。

1 材料和方法

1.1 实验材料 VARV1型静电微囊发生仪(瑞典NISCO公司);摇床(江苏太仓实验设备厂)、海藻酸钠(Sigma-Aldrich)、氯化钡(Fluca)、多聚鸟氨酸(PLO HCl)(MW 1/4 15～30 kDa,Sigma-Aldrich)、多聚赖氨酸(Mw 1/4 15～30 kDa Sigma-Aldrich);枸橼酸钠(天津化学试剂一厂,分析纯)。

1.2 实验动物 Sprague-Dawley大鼠,体重180～200 g,雌雄兼有,由军事医学科学院动物实验中心提供。

1.3 微囊制备 用静电微囊发生仪将2%海藻酸钠溶液喷入氯化钡溶液中,作用2 min,以形成海藻酸钡微球。吸出氯化钡溶液,使用生理盐水洗涤2次(尽量将游离态Ba2+去除),再将微球分别与多聚鸟氨酸溶液/多聚赖氨酸反应数分钟,形成B-PLO-A和 B-PLL-A微球,再使用生理盐水洗涤2次;之后,将两种微胶珠与0.05%的海藻酸钠溶液反应数分钟,中和微胶珠表面的正电荷,再将B-PLO-A和B-PLL-A微胶珠与枸橼酸钠溶液反应数分钟,液化囊芯,形成B-PLO-A和B-PLL-A微囊。

1.4 微囊在低渗环境的变化 分别将50个B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入盛有10 ml蒸馏水的平皿内,于37℃孵育2 h,然后用生理盐水洗涤,再向平皿内滴加0.5%台盼蓝2滴,摇匀,使微囊着色,以得到清晰的微囊轮廓。染色后继续以生理盐水洗涤,在光镜下观察微囊形态,记录孵育前后微囊直径的变化,统计破损率。

1.5 微囊直径变化测定 分别将100个B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理盐水的100 ml烧杯中,封口膜将杯口封闭,于37℃,5%CO2孵箱内培养 2周 ,分别在 0、2 d、4 d、6 d、8 d 、10 d 、12 d 、14 d 时取样,在光镜下计数B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊数量,统计微囊直径变化。

1.6 微囊体外机械强度的测定 分别将450个BPLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理盐水的100 ml烧杯中,封口膜将杯口封闭,于37℃,150 r/min的速度下在摇床上进行震荡。分别于12 h、24 h、36 h、48 h、96 h取样,于光镜下记录 B-PLO-A 微囊和B-PLL-A微囊数、破损数量,同一批制备的微囊重复实验10次,计算完整率。

1.7 B-PLO-A微囊生物相容性的测定 将B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊,植入SD大鼠腹腔内,分别于移植后1,2,4和8周,打开腹腔,肉眼观察微囊在腹腔内的分布情况。用生理盐水注射冲洗腹腔,回收微囊,在光镜下观察微囊的形态,同一批制备的微囊重复实验5次,计算完整率。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.0进行单因素方差分析,显著性检验采用t检验。

2 结果

2.1 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的形态 所制作的B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊在光镜下呈透明圆球形,膜表面光滑,微囊大小较均匀,直径为350～500 μ m,两者无明显差异。见封三彩图1.1。

2.2 微囊在低渗环境的变化 B-PLO-A微囊和BPLL-A微囊在蒸馏水的渗透应力作用下均呈现了一定的尺寸增长趋势,其中B-PLO-A微囊的直径由孵育前的(429±14)μ m,增大为(464±14)μ m,B-PLL-A微囊的直径由孵育前的(453±13)μ m,增大为(518±24)μ m,台盼蓝染色显示B-PLL-A微囊表面出现部分破损变形现象,B-PLO-A微囊的破损率为16.98%,BPLL-A微囊的破损率为34.54%。见封三彩图1.2。

2.3 微囊直径变化测定 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊于37℃,5%CO2孵箱内培养2周,直径初期均出现明显增大,4 d后直径变化趋缓,直至14 d直径变化趋于稳定;初期0～2 d内B-PLO-A微囊直径增大明显小于B-PLL-A微囊。

2.4 微囊的体外机械强度 B-PLO-A微囊经机械振荡摇 12 h、24 h、36 h、48 h、96 h 的完整率分别为100%、100%、100%、99.5±0.9%、99.3±1.0%。BPLL-A微囊经机械振荡12 h时的完整率为100%,24 h时完整率为100%,36 h时完整率为(99.1±2.6)%,48 h时完整率为(97.9±1.7)%,96 h完整率(96.2±1.5)%。统计学分析表明,B-PLO-A微囊的机械强度在96 h后高于B-PLL-A微囊,表现出更好的稳定性。见表1。

表1 机械震荡不同时间后B-PLL-A微囊和B-PLO-A微囊的完整率(n=50,%)

2.5 生物相容性 将B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊分别植入大鼠腹腔,于1、2、4和8周后打开腹腔,肉眼观察见植入B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊的大鼠,腹腔内表面及腹腔脏器表面均为光滑,无明显的异常结节,网膜血管附近有少量微囊附着。从腹腔内回收的两种微囊体积均超过植入微囊体积的90%。微囊呈透明圆球形,膜表面光滑,无结缔组织包绕。见封三图1.4。膜表面有结缔组织包绕及少量细胞黏附,无明显差异。各回收时间点微囊完整率见表2。

表2 植入大鼠体内不同回收时间B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的完整率(%)

3 讨论

海藻酸遇二价或多价阳离子,如:Ca2+或Ba2+,可与其古洛糖醛酸区域内的羟基结合生成三维网状结构。以Ba2+替代Ca2+制备的BPA微囊已被证明具有更好的机械性能和生物相容性[7-8],原因是:在与海藻酸凝结成胶体的阳离子中,Ba2+离子毒性最小,与海藻酸的结合力较Ca2+更强[12],使得BPA微囊的长期稳定性能更为优越。低稳定性的微囊,在体内环境下容易发生形变,而诱发宿主纤维组织的包绕[13-15],因此,BPA微囊良好的物理稳定性和机械强度又为其提供较好的生物相容性。还有研究表明,微囊的生物相容性很大程度上依靠其囊膜上多聚阳离子与海藻酸的结合效率[8],多聚鸟氨酸(PLO)以其与海藻酸更短的结合键,增强了这种结合效率,使得多聚鸟氨酸海藻酸(A-PLO-A)微囊具备比多聚赖氨酸海藻酸(A-PLLA)微囊更为优秀的机械强度和生物相容性[10,16]。

本研究旨在将BPA微囊与PLO结合,制备出BPLO-A微囊,将其与使用PLL制备的BPA微囊进行物理性能和生物相容性比较,探讨PLO用于BPA微囊的制备对其性能的影响。体外检测结果表明,PLO与海藻酸更高的结合效率进一步增强微囊的机械强度,提高微囊抵御低渗环境的能力,对于维持微囊形态稳定,保护包裹在其中的细胞提供保证;在体外培养14 d后,B-PLO-A微囊直径变化较B-PLL-A微囊更小,说明B-PLO-A微囊的囊膜更为稳定,能够更为有效地抵御形变的发生,减少宿主纤维组织包绕的发生,为微囊化细胞长期生存创造了潜在条件。同时,在植入大鼠腹腔2个月后,大部分B-PLO-A微囊仍然保持原有的形态,微囊完整、无结缔组织包绕,表明B-PLOA微囊除物理性能较传统的BPA微囊有所提高,其生物相容性良好。

综上所述,我们制备的B-PLO-A微囊在B-PLLA微囊基础上,体现出更好的物理性能,并保持良好的生物相容性,是一种极具应用前景的生物材料,为微囊化细胞治疗提供了新的思路。

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