当归及其炮制品水提物体外抗脂质过氧化作用

魏彦明,郭延生,曲亚玲,华永丽,邓红娟

甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070

当归及其炮制品水提物体外抗脂质过氧化作用

魏彦明＊,郭延生,曲亚玲,华永丽,邓红娟

甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070

为了研究当归及其不同炮制品水提物抗脂质过氧化的作用。采用体外小鼠肝组织自发性脂质过氧化、H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化和溶血反应,评价了当归及其炮制品水提物对脂质过氧化的抑制作用。结果表明当归及其不同炮制品水提物体外对肝组织自发性脂质过氧化的抑制能力为当归碳 ＞酒当归 ＞生当归 ＞油当归 ＞土当归;对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制能力为当归碳 ＞土当归 ＞生当归 ＞酒当归 ＞油当归;对 H2O2诱导的溶血作用的抑制能力为酒当归 ＞当归碳 ＞土当归 ＞油当归 ＞生当归,且抑制效果均呈现良好的剂量依赖关系。说明当归及其不同炮制品水提物体外都具有一定的抗脂质过氧化的作用,其中抗肝组织自发性脂质过氧化和 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的能力以当归碳最好,而抗 H2O2诱导的溶血作用以酒当归最好。

当归;炮制品;水提物;脂质过氧化

当归为伞形科多年生草本植物当归Angelicasinesis的根,主产于甘肃岷县,历代多以甘肃岷县所产作为道地药材。此外,四川、云南、湖北等省也有栽培。其药用历史悠久,历代本草均有记载,《神农本草经》谓之“当归味温,主呃逆上气”被列为中品。有补血、活血、调经止血、润肠滑肠之功效[1],为医家常用,素有“十方九归”之称。目前临床常用的炮制品有生当归、酒当归、土当归和当归碳[2],除此之外,甘肃习用油当归,并被载入《甘肃省中药炮制规范》[3],前人有“油当归偏于养血润肠,酒当归偏于活血,当归碳偏于止血之说”。现代药理研究表明,当归在心血管系统、血液系统、免疫系统、抗损伤及保护方面均显示良好的药理作用,且具有一定的抗氧化和清除自由基的作用,对脑缺氧、缺血后再灌注脑组织脂质过氧化增高具有明显的抑制作用[4],但能否在体外重现这种作用、提供直接证据,尚需进行研究,目前关于上述炮制品抗脂质过氧化的作用的研究报道较少。因此,探讨当归不同炮制品对小鼠肝匀浆脂质过氧化、红细胞膜脂质过氧化和溶血的抑制作用,可为当归临床用药和炮制理论提供更加科学合理的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠,18～22 g,雌雄各半,由兰州大学医学院实验动物中心提供,实验设施合格证号和动物合格证号为 SCXK(甘)20050007。

1.2 试剂

三氯醋酸、盐酸、H2O2和 L-抗坏血酸等均为国产分析纯,硫代巴比妥酸 (TBA),三 (羟甲基)氨基甲烷 (Tris)为进口上海分装。

1.3 仪器

Lambda7岛津紫外/可见光分光光度计 (日本),T10组织匀浆机 (德国),AL104电子分析天平(德国),加样器(Eppendorf公司),TBZ5-WS多管架自动平衡离心机 (湘仪),CW-2000型超声-微波协同萃取仪 (上海),RE-6000旋转蒸发仪 (上海), SHA-B水浴恒温振荡器(江苏)。

1.4 药物

当归的原药材采于甘肃岷县,经甘肃中医学院中药学系龙全江副教授和甘肃农业大学动物医学院中兽医教研组作生药学鉴定。取原药材,除去杂质,洗净,润透,切成薄片,晒干作为为生当归。其炮制品油当归、酒当归、当归碳、土当归均按《甘肃省中药炮制规范》和《全国中药炮制规范》要求,由甘肃中医学院龙全江副教授指导炮制。

2.3 当归及其炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制作用

2 实验方法

2.1 当归及其炮制品水提物的制备

取生当归及其炮制品各 100 g,加蒸馏水 300 mL,85℃超声-微波协同提取 2次,每次 30 min。合并两次提取液,减压浓缩至质量浓度 1 g/mL浸膏,4℃保存备用,测试时精密吸取,作适当稀释。

2.2 当归及其炮制品水提物对小鼠肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用

采用 TBA比色法略作修改[5],实验设空白管、对照管、加药管和药物底管。取 5%肝组织匀浆上清液 1 mL分别加入对照管和加药管,空白管和药物底管加 1 mL生理盐水。加药管和药物底管加入不同浓度的生当归及其炮制品水提液 0.05 mL,空白管和对照管加入蒸馏水 0.05 mL,摇匀 37℃恒温水浴振荡 2 h,各管加入 20%TCA 0.3 mL,0.1 mol/L HCl 2 mL,0.67%TBA 1 mL,沸水浴 15 min,自来水流水冷却,3000 r/min离心 10 min,以空白管标零,取上清液于 532 nm处测定吸光度A,按下式计算抑制率:

参照文献方法略作修改[6],实验设空白管、对照管、加药管和药物底管,取 0.5%红细胞悬液 0.5 mL加入到空白管、对照管和加药管,药物底管加生理盐水 0.5 mL,各管再加入生理盐水 1 mL,加药管和药物底管加入不同浓度的生当归及其炮制品水提液 0.05 mL,对照管和加药管分别加入 300 mmol/L H2O20.1 mL,空白管和药物底管加 0.1 mL生理盐水,摇匀,37℃恒温水浴振荡 2 h,加入 20%TCA 0.3 mL,0.1 mol/L HCl 2 mL,3500 r/min离心 15 min,取上清液 3 mL加入 0.67%TBA 1 mL,沸水浴15 min,自来水流水冷却,以空白管标零,于 535 nm处测定吸光度A,按下式计算抑制率:

2.4 当归及其炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞溶血的抑制作用

参照文献方法略作修改[7,8],实验设为为对照管、加药管和药物底管,取 0.5%红细胞悬液 1 mL分别加入对照管和加药管,药物底管加入 1 mL生理盐水,加药管加入不同浓度的生当归及其炮制品水提液 0.05 mL,摇匀,37℃水浴 10 min,对照管和加药管分别加入 300 mmol/L H2O20.05 mL,药物底管加 0.05 mL生理盐水,摇匀 37℃恒温水浴振荡 1 h,各管加生理盐水 4 mL,3000 r/min离心 10 min,以生理盐水标零,取各管上清液于 415 nm处测定吸光度A,按下式计算抑制率:

2.5 数据统计处理

用 SPSS 13.0统计软件进行方差分析和回归分析,测定结果以±s表示。

3 实验结果

3.1 当归及其炮制品水提物对小鼠肝组织自发性脂质过氧化的抑制效果

从表 1可以看出,生当归、油当归、酒当归、土当归和当归碳水提物在 25～200 mg/mL剂量范围内都对小鼠肝组织自发性脂质过氧化有一定的抑制作用,且随药物浓度增加,抑制率显著升高 (P＜0.05),即药物浓度 (X)与抑制率(Y)之间存在良好的依赖关系,拟合曲线,计算回归方程,生当归:y= e4.294-49.497/x,R2=0.994;油当归:y=e4.284-54.059/x,R2= 0.969;酒当归:y=0.579x-0.001x2-1.201,R2= 0.999;土当归:y=0.567x-0.001x2-1.943,R2= 0.995;当归碳:y=23.776lnX-50.315,R2=0.998。从图 1可以看出,不同炮制品 IC50从小到大依次为当归碳、酒当归、生当归、油当归和土当归,即生当归及其炮制品水提物对小鼠肝组织自发性脂质过氧化能力依次为当归碳 ＞酒当归 ＞生当归 ＞油当归 ＞土当归。表明当归经炒碳和酒炒后对其抑制肝组织自发性脂质过氧化的能力增强,而当归经油炒和土炒后抑制能力降低。在此试验条件下L-抗坏血酸在 4～10 mg/mL剂量范围内能有效抑制肝组织自发性脂质过氧化作用,I C50为 4.64 mg/mL(图 1)。

表 1 当归炮制品水提物体外对小鼠肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用Table 1 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on mouse liver homogenates spontaneous antilipid peroxidationin vitro(±s)

表 1 当归炮制品水提物体外对小鼠肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用Table 1 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on mouse liver homogenates spontaneous antilipid peroxidationin vitro(±s)

注:1.a,b……表示同一炮制品不同浓度之间比较,不同字母表示差异显著(P＜0.05),相同字母,表示差异不显著(P＞0.05)。Notes:1.a,b… represents the Comparison between different Concentrations of same processed product,and difference letter has significant difference (P＜0.05),the same letter no significant difference(P＞0.05).

3.2 当归及其炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制效果

从表 2可以看出,生当归、油当归、酒当归、土当归和当归碳水提物对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化具有一定的抑制效果,除生当归外,其余炮制品在 25～200 mg/mL的剂量范围内,抑制率随着药物浓度的增高而显著增高 (P＜0.05),即炮制品药物浓度(X)与抑制率(Y)之间存在着良好的依赖关系。拟合曲线,计算回归方程,生当归:y=34.207-0.1x+0.001x2,R2=0.997;油当归:y=2.665x0.495, R2=0.972;酒当归:y=e3.817-41.086/x,R2=0.977;土当归:y=9.633+0.275x,R2=0.999;当归碳:y= 4.097+0.410x,R2=0.989。不同炮制品对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的 I C50由小到大依次为当归碳、土当归、生当归、酒当归、油当归 (图 1),即抗氧化能力当归碳 ＞土当归 ＞生当归 ＞酒当归 ＞油当归。表明当归炒碳和土炒后增强了对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制能力,而经酒炒和油炒后抗红细胞膜脂质过氧化的能力降低。在此试验条件下L-抗坏血酸在 4～10 mg/mL剂量范围内能有效抑制 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化作用,I C50为 6.52 mg/mL(图 1)。

表 2 当归及其炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化的抑制作用Table 2 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on erythrocytic membrane anti-lipid peroxidation induced by H2O2in vitro(x ±s)

注:1.a,b……表示同一炮制品不同浓度之间比较,不同字母表示差异显著(P＜0.05),相同字母,表示差异不显著(P＞0.05)。Notes:1.a,b… represents the Comparison between different Concentrations of same processed product,and difference letter has significant difference (P＜0.05),the same letter no significant difference(P＞0.05).

3.3 当归及其炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞溶血的抑制作用

从表 3可以看出,生当归、油当归、酒当归、土当归和当归碳对 H2O2诱导的红细胞溶血具有一定抑制作用,同一炮制品在 12.5～200 mg/mL的剂量范围内,抑制率随着药物浓度的增高而呈现出不同的增高趋势,其中生当归和油当归各浓度之间抑制率具有显著差异性 (P＜0.05),酒当归 25 mg/mL与50 mg/mL之间抑制率差异不显著 (P＞0.05),其余浓度之间差异显著 (P＜0.05),土当归 12.5 mg/mL与 50 mg/mL之间差异不显著 (P＞0.05),其余浓度之间差异显著 (P＜0.05),当归碳表 50 mg/mL与100 mg/mL之间抑制率差异不显著 (P＞0.05),其余浓度之间差异显著 (P＜0.05)。拟合曲线,计算回归方程,生当归:y=1.261x-0.004x2-12.349,R2=0.988;油当归:y= e4.77-31.466/x,R2=0.998;酒当归:y=e4.452-7.828/x,R2=0.966;土当归:y=12.786+ 1.038x-0.003x2,R2=0.983;当 归碳:y= e4.658-18.207/x,R2=0.969。不同炮制品对 H2O2诱导的红细胞溶血的 IC50由小到大依次为酒当归、当归碳、土当归、油当归和生当归 (图 1),即抑制红细胞溶血的能力酒当归 ＞当归碳 ＞土当归 ＞油当归 ＞生当归。表明当归经炮制后对 H2O2诱导的红细胞溶血的抑制能力都有所增强。在此试验条件下L-抗坏血酸在 4～10 mg/mL剂量范围能有效抑制H2O2诱导的红细胞溶血作用,I C50为 6.89 mg/mL(图 1)。

表 3 当归炮制品水提物对 H2O2诱导的红细胞溶血的抑制作用Table 3 Inhibitory effects ofwater extracts from processed products of Chinese angelica on erythrocyte hemolysis induced by H2O2in vitro(x ±s)

4 讨论

氧自由基及其介导的脂质过氧化反应参与了许多疾病的发生与发展,如动脉硬化症、高血压、冠心病、骨关节炎、白内障以及帕金森氏病等。现代研究表明,当归能有效地清除超氧自由基,减少脂质过氧化反应等。但对当归及其炮制品体外抗脂质过氧化的研究较少,仅见吴慧平等报道了当归炭、焦当归、酒当归、生当归和炒当归水煎液对 FRGS诱导肝组织过氧化脂质的抑制作用[9]。因此,选择临床常用的当归炮制品种以及多种指标评价当归不同炮制品体外抗脂质过氧化作用,可为当归临床用药和炮制理论提供更加科学合理的理论依据。

体外实验表明,生当归及其炮制品水提物对小鼠肝组织自发性过氧化、H2O2诱导的红细胞膜脂质过氧化和红细胞溶血作用均有一定的抑制作用,其抑制作用随着药物浓度的升高逐渐升高,呈现良好的剂量依赖关系。但当归及其炮制品抑制脂质过氧化的能力因选择的评价方法不同而具有一定的差别,其抑制肝组织自发性过氧化能力为当归碳 ＞酒当归 ＞生当归 ＞油当归 ＞土当归,这与吴慧平等报道当归碳 ＞酒当归 ＞生当归一致[9];抑制 H2O2诱导的红细胞膜过氧化的能力为当归碳 ＞土当归 ＞生当归 ＞酒当归 ＞油当归,抑制 H2O2诱导红细胞溶血的能力为酒当归 ＞当归碳 ＞土当归 ＞油当归 ＞生当归。

图 1 当归炮制品水提液体外抗脂质过氧化 I C50Fig.1 IC50ofwater extracts from processed productsof Chinese angelica on anti-lipid peroxidation in vitro

据文献报道,当归水溶性成分阿魏酸和多糖都具有一定的抗氧化作用,如吴建农等报道阿魏酸不仅能对抗氧自由基,使超氧自由基、羟自由基和过氧化氢等氧自由基生成减少,而且还能与膜磷脂酰乙醇胺结合,使膜脂质不受氧自由基的侵袭,从而发挥抗脂质过氧化作用[10];李贵荣等报道,当归多糖能够有效的清除氧自由基和羟自由基,且纯化后的当归多糖对氧自由基和羟自由基的清除作用均小于其粗品多糖[11],凌小曼等还发现,当归多糖能升高血瘀动物心、脑、肾、胰四脏器超氧化物歧化酶 (SOD)活性,降低心、脑、肾、胰四脏器丙二醛 (MDA)含量,具有一定的抗氧化能力[12]。另据报道,生当归与炮制品之间阿魏酸含量有一定的差异,并且随炮制温度的升高,阿魏酸含量降低,以当归炭最为明显[13]。刘汉珍等测定了当归及其炮制品中的多糖含量,以酒炙品中含量最高,当归炭中含量最低[14],即当归经炒碳后阿魏酸和多糖含量均低于生当归,但本实验结果表明当归碳对肝组织自发性过氧化、H2O2诱导的红细胞膜过氧化和 H2O2诱导红细胞溶血的抑制能力均大于生当归。据此推测,当归不同炮制品抗氧化能力除与阿魏酸和多糖含量变化相关外,其抗氧化作用的成分可能还与其它未知的成分有密切关联,很有必要进一步研究。

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Anti-lipid peroxida?tion of the Water Extracts from Processed Products of Chinese Angelicain vitro

WEI Yan-ming＊,GUO Yan-sheng,QU Ya-ling,HUA Yong-li,DENG Hong-juan
Gansu Agriculture University,College of Veterinary M edicine,Lanzhou 730070

To study the effect on Anti-lipid peroxidation of water extracts from processed products of Chinese angelica, mouse liver homogenates spontaneous lipid peroxidation,erythrocyticmembrane lipid peroxidation and erythrocyte hemolysis induced by H2O2in vitro were used to assess their capacity of Anti-lipid peroxidation.The results showed that the rate of inhibition on mouse liver homogenates spontaneous lipid peroxidation was in sequence of carbonized Angelica＞wine-broiled angelica＞raw Angelica＞oil-broiled Angelica＞Foci subsoil-broiled angelica;the rate of inhibition on erythrocytic membrane lipid peroxidation induced by H2O2was in sequence of carbonized Angelica ＞Foci subsoilbroiled angelica＞raw Angelica＞wine-broiled angelica＞oil-broiled Angelica;the rate of inhibition on erythrocyte hemolysis induced by H2O2was in sequence ofwine-broiled angelica＞carbonized Angelica＞Foci subsoil-broiled angelica＞oil-broiled Angelica＞raw Angelica.And inhibition effect showed a better dose-dependent relation.It was concluded that the water extracts from processed products of Chinese angelica showed certain inhibitory effect on anti-lipid peroxidation in vitro,and carbonized product had the best inhibition on liver homogenates spontaneous lipid peroxidation and erythrocytic membrane lipid peroxidation induced byH2O2,butwine-broiled angelica showed the best inhibitory effecton erythrocyte hemolysis induced by H2O2.

Chinese angelica;processed products;water extracts;anti-lipid peroxidation

R285.5;Q593.1

A

1001-6880(2010)05-0878-06

2009-07-17 接受日期:2009-09-21

国家自然科学基金项目“当归不同炮制品清除自由基和抗脂质过氧化的作用”(30671541)

＊通讯作者 Tel:86-931-7632210;E-mail:weiym@gsau.edu.cn