已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞凋亡的影响

黄小琼，饶子亮，刘盛来，钟志勇，王 刚，严家荣，陈系古

(广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞凋亡的影响

黄小琼，饶子亮，刘盛来，钟志勇，王 刚，严家荣，陈系古

(广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

目的 探讨已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响。方法 以小鼠透明带3蛋白的第330～342个氨基酸的序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明带多肽并作免疫原，免疫SPF级BALB/c雌性小鼠。设对照、模型和已烯雌酚组。灌胃给药4周后，采用Tunel方法检测颗粒细胞与卵母细胞的细胞凋亡数并作统计学分析。结果 已烯雌酚组可显著减少小鼠卵巢卵母细胞的凋亡率(P＜0.05)。结论 已烯雌酚组能改善免疫性卵巢早衰小鼠体重降低症状并能诱导发情。已烯雌酚能改善免疫性卵巢早衰小鼠症状的机制可能是由于能有效地抑制卵母细胞的凋亡所引起的。

卵巢早衰;已烯雌酚;细胞凋亡

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指月经初潮年龄正常或青春期延迟。第二性征发育正常的妇女在40岁以前由于卵巢功能衰退而持续性停经并伴有血促性腺激素升高，FSH＞40 IU/L和(或)LH＞30 IU/L，雌二醇减少 (E2＜91.75 pmol/L，至少持续6个月)。不仅易出现抑郁、焦虑、敌对、恐惧、人际交往困难等情绪和社交方面的心理卫生问题，而且骨质疏松症、心血管疾病、老年性痴呆等疾病的发生常提前，是一类严重影响妇女生殖健康及身心健康的卵巢功能减退的疾病。作为一类人工合成雌激素药物，二乙基已烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)被广泛应用于治疗卵巢早衰症。本实验着重了解已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响，探讨已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠症状改善作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物来源

BALB/c小鼠，雌性，15～18 g，36 只，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:2008A023。动物饮水、垫料、笼具均经132℃ 10 min高压蒸汽灭菌，饲料为本中心配制加工的配合颗粒饲料(合格证号2008D007)并经121℃ 30 min高压蒸汽灭菌，水和饲料自由饮食。SPF级BALB/c小鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级实验动物室，动物实验环境设施合格证号:粤监证字2007C099。

1.2 主要实验仪器及检测试剂盒

1.2.1 实验仪器:显微镜:厂家:OLYMPUS，型号:CX21。电子天平:厂家:上海精密科学仪器有限公司。型号:YP3001N，精度:0.1 g。

1.2.2 实验药物及检测试剂:小鼠透明带多肽(其分析纯度＞95%):由杭州中肽生物有限公司提供，批号:CC－11－030。弗氏完全佐剂:Sigma公司产品，批号:038K8726;弗氏不完全佐剂:Sigma公司产品，批号:086K8905。己烯雌酚:合肥久联制药有限公司，批号:20080104。细胞凋亡检测试剂盒:厂家:Rocho，批号:14492200。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠透明带多肽溶液的配制:称取1 mg的透明带3粉末，加入三蒸水配成0.2 mg/mL的溶液。免疫试剂:将小鼠透明带多肽溶液和弗氏完全佐剂按照1∶1的比例混合，搅拌30 min，充分混匀。免疫强化试剂:将小鼠透明带多肽溶液和弗氏不完全佐剂按照 1∶1的比例混合，搅拌 30 min，充分混匀。

1.3.2 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立:BALB/c小鼠36只，随机分为对照组12只和模型组24只。对照组注射生理盐水;模型组按文献方法，以小鼠透明带3的第330～342个氨基酸序列(NSSSSQF QIHGPR)所合成透明带多肽为免疫原，以其免疫SPF级BALB/c雌性小鼠。在足底及腹部皮肤皮下多点注射，每2周1次，共注射3次，第1次加入等量弗氏完全佐剂，第2次和第3次加入等量弗氏不完全佐剂以制备免疫性POF动物模型。造模之日起，每天早上8:00阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期的变化。以出现动情周期紊乱表示造模成功。对动情周期无影响，阴道脱落细胞涂片显示卵巢功能未抑制者予以剔除。造模成功后，将BALB/c小鼠随机分为模型组、己烯雌酚组，每组12只。对照组和模型组给予生理盐水，己烯雌酚组按0.15 mg/kg剂量灌胃给药。均于第三次免疫后开始灌胃，共灌胃4周，每周称重1次、休息1 d。第3次免疫4周后常规无菌方法留双侧卵巢备用，采用Tunel方法检测颗粒细胞与卵母细胞的细胞凋亡数。

1.4 统计方法

采用SPSS11.5数据统计软件进行数据处理，计量资料采用组间t检验，差异显著性设为a=0.05。数据用±s表示。

2 结果

2.1 一般状态

从首次免疫后至第 25天开始，模型组小鼠表现为易激惹，大便干结，小鼠逐渐表现为活动频度减少，对刺激反应淡漠，皮毛无光泽。

2.2 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠体重变化情况

实验结果表明，模型组小鼠在第3周至第8周的体重与对照组比较，显著性降低体重(P＜0.05)。已烯雌酚组小鼠在第10周的体重与模型组比较，体重显著增加(P＜0.05)(图1)。

2.3 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠性周期的影响

实验结果表明，各组小鼠进行皮下注射后，均行阴道脱落细胞涂片观察性周期。模型组动情期不典型，角化细胞数减少，与上皮细胞、白细胞并见;第35天左右出现动情周期紊乱，动情间期延长，渐至无动情周期，仅为动情间期的白细胞，时可见上皮细胞相混杂。已烯雌酚治疗组只见动情期角化细胞。空白对照组有91.7%(11/12)的动物、模型组有16.7%(2/12)的动物仍维持正常的性周期，其余动物均表现为性周期紊乱。已烯雌酚组100%动物均表现为无明显周期(一直处在动情期)(表1)。

图1 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠体重的影响Fig.1 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the body weight of mice in immune premature ovarian failure mice

表1 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠性周期的影响(单位:只)Tab.1 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the sexual cycle in immune premature ovarian failure mice(Unit:number)

2.4 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞凋亡的影响

Tunnel检测实验结果表明，模型组小鼠卵巢中颗粒细胞的凋亡率与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。已烯雌酚组小鼠卵巢中颗粒细胞的凋亡率与模型组比较，有所降低，但无显著性差异(P＞0.05)。模型组小鼠卵母细胞的凋亡率与对照组比较，具有显著性差异(P ＜0.05)。已烯雌酚组小鼠卵母细胞的凋亡率与模型组比较，具有显著性差异(P ＜0.05)(表2和图2，见彩插5)。

表2 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞的凋亡率影响(±s)Tab.2The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary aapoptosis in immune premature ovarian failure mice(±s)

表2 已烯雌酚对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞的凋亡率影响(±s)Tab.2The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary aapoptosis in immune premature ovarian failure mice(±s)

注:与对照组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，**P＜0.01。Note:Compared with control group，△△P ＜0.01;compared with model group，**P ＜0.01.

组别Group N卵母细胞凋亡率Oocyte apoptosis对照组Number颗粒细胞凋亡率Granulosa cell apoptosis rate Control group 12 5.60±1.94 2.25±0.79模型组 Model group 12 12.42±2.42△△ 7.08±1.65△△已烯雌酚组 DES group 12 9.40±2.96 4.90±0.99**

3 讨论

目前，卵巢早衰的发病率为1.0%～3.8%，患者在40岁之前出现闭经、不孕不育、一系列更年期症状及老龄化表现，如潮热、烦躁失眠、阴道干燥等。目前认为，在自身免疫性卵巢早衰的发病机理、早期诊断方法及新的治疗方法等方面，仍有许多需要进一步研究之处。本实验参考朱玲等［1］报告的造模方法，根据抗透明带抗体可以引起自身免疫性卵巢炎，并且可以加速卵母细胞的破坏和耗竭而致自身免疫性卵巢早衰这个原理，以卵母细胞透明带的片段创新地建立了小鼠的自身免疫性卵巢早衰动物模型。实验结果表明，从第1次免疫后的约第25天开始，模型组小鼠表现为易激惹，大便干结，动情期不典型，角化细胞数减少，与上皮细胞、白细胞并见;第35天左右出现动情周期紊乱，动情间期延长，渐至无动情周期 ，仅为动情间期的白细胞，时可见上皮细胞相混杂。小鼠逐渐表现为活动频度减少，对刺激反应淡漠，皮毛无光泽。模型组小鼠在第三周至第八周的体重与对照组比较，差异显著(P＜0.05)。模型组仅有16.7%(2/12)的动物维持正常的性周期，而空白对照组有91.7%(11/12)的动物维持正常的性周期，结果提示本实验所注射透明带片段有效地影响了卵巢的功能。模型组小鼠卵巢中颗粒细胞、卵母细胞的凋亡率与对照组比较，差异显著(P＜0.05)。实验结果提示本实验所注射透明带片段可能成功诱导了小鼠发生自身免疫性卵巢炎，导致卵巢细胞的凋亡。

妇女在绝经前，卵巢卵泡的生长发育在不间断地进行，绝大部分卵泡要在卵泡发育的不同时期最终闭锁消失，仅少数卵泡发育成熟、排卵。机体依靠凋亡控制着卵泡的发育和闭锁，使卵巢组织维持一定的成熟卵泡数，既保证了生殖的需要，又不至于过多排卵。根据文献报道［2－4］，卵巢早衰妇女卵泡数量急剧减少，不能分泌足够的激素及生长因子，卵巢因卵泡数减少而出现功能衰退伴随卵巢周期卵泡发育成熟关系最密切的是卵巢颗粒细胞。颗粒细胞是雌激素、孕激素的重要来源，卵泡颗粒细胞的增殖和分化是卵泡不断发育至成熟的基本条件，而它的凋亡是导致卵泡闭锁的重要且直接的诱导因素。已烯雌酚为人工合成的非甾体雌激素。具有雌激素的一般作用。已烯雌酚应用可产生类似青春期的生理变化，可改善如潮热、烦躁失眠、阴道干燥等卵巢早衰症状。本实验研究表明，已烯雌酚组小鼠卵母细胞的凋亡率与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，已烯雌酚组小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率与模型组比较，有所降低，但无显著性差异(P ＞0.05)。根据李忠香等文献报道［5］早期卵泡可能存在不同于晚期卵泡的闭锁机制，早期卵泡闭锁始于卵母细胞形态结构异常，随后累及到颗粒细胞。晚期卵泡，颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制。本实验模型可能多数处于早期卵泡。所以出现已烯雌酚不能降低颗粒细胞的凋亡率的结果。已烯雌酚组小鼠在第十周的体重与模型组比较，能显著增加体重(P＜0.05)。100%动物均表现为动情期。结果提示，已烯雌酚组能改善免疫性卵巢早衰小鼠体重降低症状并能诱导发情，减少动情间期。已烯雌酚能改善免疫性卵巢早衰小鼠症状的机制可能是由于能有效地抑制卵母细胞的凋亡所引起的。

致谢:衷心感谢广东省计划生育科学技术研究所李红梅主任在课题合作研究过程中所给予的指导和支持。

［1］朱玲 ，罗颂平 ，许丽绵，等.左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠抗卵巢抗体的影响［J］.现代中西医结合杂志，2006，15(4):435－437.

［2］张端莲 ，邓成国 ，杨虹，等.当归注射液对辐射损伤后小鼠卵巢颗粒细胞凋亡影响的实验研究［J］.中医杂志，2003，22(12):743－745.

［3］刘润侠，党慧敏 ，刘艳巧，等.助孕胶囊对多囊 巢大鼠巢细胞凋亡的影响［J］.西安交通大学学报，2007，28(5):585－587.

［4］马晓杋，戴明，吴焕濅，等.针刺对围产期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及相关基因表达的影响［J］.中国针灸，2007，25(5):357－361.

［5］李忠香，王自能.生育年龄妇女早期卵泡细胞凋亡和 Bcl－2/BAX蛋白表达［J］.中国病理生理杂，2004，20(10):1908－191.

The Effect of Diethylstilbestrol(DES)on the Ovary Apoptosis in Immune Premature Ovarian Failure Mice

HUANG Xiao－qiong，RAO Zi－liang，LIU Sheng－lai，ZHONG Zhi－yong，WANG Gang，YAN Jia－rong，CHEN Xi－gu
(Guangdong Medical Laboratory Animal Center，Foshan 528248，China)

Objective To investigate the influence of diethylstilbestrol(DES)on the apoptosis of ovarian granulosa cells and oocyte in immune premature ovarian failure(POF)mouse.Methods Zona pellucida peptides as immunogens were synthesized according to the No.330～342 amino acid sequence(NSSSSQFQIHGPR)of mouse zona pellucida 3 protein and then was used to immune SPF BALB/c female mouse.Zona pellucida peptides as immunogens，which were synthesized according to the No.330～342 amino acid sequence(NSSSSQFQIHGPR)of mouse zona pellucida 3 protein，was used to immune BALB/c female mouse.And then these mice were divided into three groups as control，model and diethylstilbestrol.Apoptotic granulosa cells and oocyte were detected by Tunel assay after 4 weeks'intragastric administration and the data was statistically analysed.Results In the diethylstilbestrol(DES)group，oocyte apoptosis rate significantly reduced(P＜0.05).Conclusions Diethylstilbestrol(DES)can improve the symptom of weight loss in the immune premature ovarian failure mouse and induce its oestrum.DES may inhibit the apoptosis of oocyte，thereby improving the symptoms of immune premature ovarian failure mice.

Premature ovarian failur;Diethylstilbestrol(DES);Cells apoptosis

R－33

A

1671－7856(2010)06－0039－04

2010－01－07

图2 已烯雌酚对兔疫性卵巢早衰小鼠卵巢细胞的凋亡率影响Tunnel检测图片
Fig.2 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary apoptosis in immune premature ovarian failure mice

注： A: 空白对照组 400×；B: 模型组 400×；C: 已烯雌酚组 400×
Note: A: blank control group 400×; B: model group 400×; C: DES group 400×

广东省科技计划项目(2008A060202002)。

黄小琼(1973－)，女，兽医师，从事实验动物和比较医学研究工作。

王刚(1966－)，男，高级兽医师，从事实验动物和比较医学研究工作。E－mail:gdmlac@gmail.com