复方中药软膏剂的透皮效果研究*

张少华,任丽琴,包永占,秦建华,史万玉,钟秀会

(河北农业大学动物科技学院,河北保定 071001)

中药透皮剂是一种集传统工艺与现代药剂技术相结合的新型中药制剂。本试验通过体外透皮试验,以中药软膏剂中绿原酸成分为标记物,应用高效液相色谱法(high-perform ance liquid chromatography,HPLC)测定透过液中绿原酸的含量,评价不同的中药剂型和不同的透皮促渗剂对中药软膏剂透皮效果的影响,并建立中药软膏剂中绿原酸透过皮肤的动力学曲线,评价中药软膏剂的透皮效果,旨在为临床提供安全有效药物奠定试验基础[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品 金银花、当归、蒲公英、红花、冰片等购于安国市祁州中药厂;硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡、氮酮等购于保定华新试剂仪器有限公司。

1.1.2 主要仪器 Agilent 1200液相色谱仪,美国惠普公司生产;TT-6(B)透皮吸收试验仪,天津市正通科技有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 中药软膏剂的制备

1.2.1.1 中药配方 当归,益母草,忍冬藤,蒲公英,苦地丁 ,瓜蒌 ,红花,青翘,枳壳 ,牛蒡子 ,黄芩 ,川芎,青皮,木通,王不留行 ,丹参 ,冰片,蟾酥 ,通草 ,萹蓄,地榆,按比例组成复方。

1.2.1.2 中药的制备 中药超微粉:为将单味中药各自经超微粉粉碎机粉碎后按照配方混合而成;中药超微粉煎剂:为将上述混合好的中药超微粉加水煎成1∶1的煎剂即可;普通煎剂:为将中药粗粉加水煎成1∶1的煎剂即可[2]。

1.2.1.3 基质的制备 取硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林及液体石蜡加热溶化为油相。另将甘油及蒸馏水加热至90℃,再加入三乙醇胺和山梨酸钾溶解为水相。然后将水相缓缓倒入油相中,边加入边搅拌直至冷凝[3]。

1.2.1.4 透皮促渗剂的加入 将中药和不同的促渗剂加入到基质当中,分别制成含 90 g/L冰片、45 g/L冰片+45mL/L氮酮、90 mL/L氮酮3种中药软膏剂。

1.2.2 中药软膏剂的稳定性试验

1.2.2.1 离心试验 取中药软膏剂10 g放入带刻度离心管中,3 000 r/min离心30 min,观察有无分层及破乳现象。

1.2.2.2 耐寒耐热试验 将中药软膏剂置于具塞试管内,分别置 55℃恒温箱 6 h和-15℃冰箱24 h,观察有无分层破乳、霉败以及色泽、均匀性改变等现象[4]。

1.2.2.3 加速试验 将中药软膏剂装入具塞试管内,置于温度为40℃±2℃、相对湿度为75%的恒温培养箱中,连续放置3个月定期考察,观察有无分层破乳、霉败以及色泽、均匀性改变等现象[5]。

1.2.3 中药软膏剂的体外透皮试验

1.2.3.1 皮肤处理 剥离已脱毛24 h小鼠的腹部皮肤,去净皮下脂肪,用生理盐水洗净浸泡,置4℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 透皮试验 将处理好的皮肤平展于Franz扩散池装置中,固定,给药室给予2 g透皮用软膏剂,接收液为生理盐水6mL,磁力搅拌器搅拌,整个装置放于39℃恒温水浴中,药物从给药室渗透到接收池,取适量接受液作为样品,所取样品以上述色谱条件进样20μL,测定绿原酸的含量[6]。

1.2.3.3 不同取样点的累计经皮渗透量 M按下式计算:

式中,M为累计透皮渗透量;Cn为各取样点时取样液的浓度;V为接收池体积;Ci为各取样点取样液的浓度;Vi为取样体积[7]。

1.2.4 HPLC的测定方法

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm ×5.0 μm);流 动 相:乙 腈-水-磷 酸(10∶90∶0.05);流速为:1.0 mL/min;进样量:20μL;柱温:25℃;检测波长327 nm。

1.2.4.2 标准曲线的建立 取绿原酸标准品5mg,精密称定,加500 mL/L甲醇溶解,配成100μg/mL的标准液 50 mL。分别精密量取0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 mL于 50 mL 量瓶中,用甲醇定容,摇匀 ,每次进样20μL,以绿原酸标准品的峰面积(A)与药物浓度(C)进行线性回归得回归方程及标准曲线[8]。

1.2.4.3 样品的测定 取样品按样品溶液制备操作,分别吸取对照品溶液与样品溶液各20μL进样,按上述色谱条件测定,记录色谱,计算结果。

1.2.4.4 精密度试验 精确吸取适当浓度的绿原酸标准品溶液20μL,连续进样5次,计算绿原酸的峰面积和RSD。

1.2.5 不同中药剂型对中药透皮剂中药物含量的影响

1.2.5.1 供试品溶液的制备 取本品约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入500 mL/L甲醇25 mL,密塞,称定重量,超声提取30min,放冷后,以甲醇补足损失的重量,摇匀,滤过。取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得[9]。

1.2.5.2 样品的测定 取样品按样品溶液制备操作,分别吸取对照品溶液与样品溶液各20μL进样,按上述色谱条件测定,记录色谱,计算结果。

1.2.5.3 重复性试验 按照含量测定方法,对同一样品制备供试液,平行做5份,测得峰面积并计算RSD。

1.2.6 不同中药透皮促渗剂对透皮效果的影响

1.2.6.1 供试液的制备 将上述试验筛选出的最佳中药剂型制备成3种含不同促渗剂的中药透皮剂,各取2 g加在给药室中;接受池内加6mL生理盐水,使皮肤与接受液面接触,在39℃±0.1℃条件下,连续搅拌,10 h后各取样2 mL,用于绿原酸透皮量的测定[10]。

1.2.6.2 样品的测定 样品用0.45μm微孔滤膜过滤后,取20μL进行HPLC测定,重复测定3次,测得峰面积并计算含量。

1.2.6.3 重复性试验 同1.2.5.3。

1.2.7 中药软膏剂透过皮肤的动力学曲线

1.2.7.1 供试液的制备 将上述试验筛选出的最佳中药剂型和最佳透皮促渗剂制备成最佳中药透皮剂,取2 g加入到给药室中;接受池内加6mL生理盐水,使鼠皮与接受液面接触,在39℃±0.1℃条件下,连续搅拌,分别于加样后连续 7 h各取样2mL,用于绿原酸透皮量的测定[11]。每次取样后补加生理盐水2 mL。

1.2.7.2 样品的测定 样品用0.45μm微孔滤膜过滤后,取20μL进行HPLC测定,重复测定3次,测得峰面积并计算含量。

1.2.7.3 重复性试验 同1.2.5.3。

2 结果

2.1 中药乳膏剂的质量鉴定结果

中药乳膏剂的稳定性试验结果离心试验、耐寒耐热试验与加速试验中均未见乳膏出现分层破乳、霉败以及色泽、均匀性改变等现象。乳膏剂应色泽均匀,质地细腻,有适当的黏稠性,易于涂布皮肤,无粗糙感,具有一定的相对稳定性。通过耐寒耐热试验、离心试验和加速试验发现:中药乳膏具有良好的稳定性,各项稳定性结果均符合要求。对于有效期要求两年的产品,在温度37℃～40℃,相对湿度75%以上的条件下保存3个月,产品稳定,则可暂定为有效期2年。所以该中药乳膏的保质期暂可定为2年。

2.2 标准曲线的建立

2.2.1 标准曲线 以绿原酸标准品配制成系列浓度溶液。按照上述色谱条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标(Y),绿原酸含量为横坐标(X)进行回归,得回归方程:y=64.944x-5.359 6(R2=0.999 2),表明在0.05μg/mL～12.8μg/mL范围内线性良好(图1)。

图1 标准曲线Fig.1 Standard cu rve

2.2.2 精密度试验 精确吸取0.2μg/mL的绿原酸标准品溶液20μL,连续进样5次,计算绿原酸的峰面积RSD为0.98%,表明进样的准确性及仪器精密度良好。

2.3 不同中药剂型对中药透皮剂中药物含量的影响

试验结果表明,中药超微粉直接入药的中药透皮剂中绿原酸的含量为174μg/g,超微粉煎剂入药的中药透皮剂中绿原酸的含量为88μg/g,普通煎剂入药的中药透皮剂中绿原酸的含量为62.1μg/g,说明中药超微粉直接入药效果最佳(图2)。

图2 不同中药剂型中药透皮剂绿原酸的HPLC图谱Fig.2 The chlorogenic acid H PLC patterns in different transdermalagentsof Chinesemedicine formulations

2.4 不同中药透皮促渗剂对透皮效果的影响

试验结果表明,含90 g/L冰片为透皮剂的软膏剂其10 h绿原酸透过量为5.94μg,含45 g/L冰片+45 mL/L氮酮为透皮剂的软膏剂其10 h绿原酸透过量为6.6μg,含90 mL/L氮酮为透皮剂的软膏剂其绿原酸透过量为 4.02μg,说明45 g/L冰片+45 mL/L氮酮作为透皮剂效果最佳(图3)。

2.5 最佳中药透皮剂透过皮肤的动力学曲线

绿原酸累计透过量随时间延长而不断增加,累计7 h总透过量为2.726μg(表1)。1 h～4 h绿原酸的经皮透过速率不断升高,5h后透皮速率恒定,呈现近似零级动力学特征(图4)。表明该透皮剂具有一定的体外透皮效果,能保持一定的给药速率。

图3 不同软膏剂中药透皮剂绿原酸的HPLC图谱Fig.3 The chlorogenic acid HPLC patterns in different transdermaloin tment medicine

表1 绿原酸累积透过量Table1 The penetrated amount of chlo rogenic acid across the skin

图4 绿原酸透过皮肤的动力学曲线Fig.4 The perm eation kinetic profile of chlorogenic acid across the skin

3 讨论

3.1 中药乳膏剂透皮试验研究

中药乳膏剂为中药复方制剂,成分复杂,很难测定所有成分的透皮量,一般以复方制剂中某种有效成分的透皮量作为评价指标,研究复方制剂的透皮效果。复方中以金银花为主药,其主要成分是绿原酸,所以通过测定中药乳膏剂中绿原酸的体外透皮量,来验证透皮剂的不同中药剂型和不同促渗剂对中药软膏剂透皮效果的影响是具有代表意义的[12]。

药物透皮试验方法分为体外透皮试验和体内透皮试验,中药透皮剂由于成分复杂,含量低,很难进行体内透皮试验的研究。因此该试验采用体外透皮试验方法进行研究。常用经皮肤渗透研究的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等,不同动物皮肤渗透性大小不一,根据奶牛乳腺皮肤的特点,采用渗透性适中的小鼠皮肤作为体外透皮试验的皮肤模型[13]。

3.2 中药超微粉软膏剂的优点

超微粉碎技术应用到中药制剂中同样显示出独特的优势,研究结果表明,采用超微粉碎技术得到的中药制剂与用传统工艺得到的中药制剂相比,增加药物吸收率,提高生物利用度,有利于保存生物活性成分,提高药效,节省资源,降低生产成本,可明显提高药效和产品质量。中药大部分是复方,复方由各药材组成,细胞破壁后,细胞内的水分及油分迁出,使微粒子表面呈现半湿润状态,粒子与粒子之间会形成稳定的粒子团(或称这为微颗粒),每一个粒子团都包含相同比例的中药成分[14]。该粒子团的物理结构随组分的HLB值(亲水、亲油平衡值)、延展性、破碎性、含水(油)率、相对密度等不同组合和不同的相互作用而不同。这种结构会使中药材各有效成分均匀化,使各种成分均匀地被吸收,这也可以增强药物的作用效果[15]。

3.3 透皮促渗剂的筛选

通常透皮吸收促进剂单独使用的效果不太理想,联合使用两种以上渗透促进剂可发挥协同促渗作用,从而减少促渗剂的用量,降低毒性反应,又可使主药发挥最佳效能,氮酮、冰片是常见的渗透促进剂[16]。因此,我们对这两种渗透促进剂的渗透促进效果进行了考察,从本试验可见,冰片与氮酮混合使用,渗透促进效果最佳,说明冰片和氮酮在透皮过程中起协同作用。冰片单独使用和氮酮单独使用,二者透皮效果均不佳,但冰片强于氮酮作用,说明在促渗过程中冰片起主导作用,氮酮能起到辅助渗透作用。中药复方成分复杂,冰片偏脂溶性而氮酮偏水溶性,二者合用有利于有效成分的整体吸收[17]。

3.4 中药透皮剂透过皮肤的动力学特征

试验结果表明,软膏剂中的中药有效成分能有效地透过皮肤,这可以较准确地反映药物在实际应用时的透皮吸收过程,为临床应用提供了依据。本试验所得的动力学曲线类似零级动力学,说明涂膜剂具有维持恒定的血药浓度或药理效应,延长作用时间等优点[18]。这些结果与其他关于中药成分体外透皮研究结果相类似。

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