云南省规模化猪场秋冬季猪繁殖与呼吸综合征病毒感染状况调查*

蒲杨柳,杨贵树,李应进,宋春莲,尹革芬*

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201;2.晋宁县晋城兽医站,云南昆明 650605)

猪呼吸道疾病综合征(PRDC)是一类由多种疾病因素引起的猪呼吸道疾病,它比普通的呼吸道疾病传播更广、病情更重,也更难以防制,发病率30%～80%,死亡率在5%～30%或以上,造成了严重的经济损失[1-2]。目前PRDC己上升为规模化猪场的主导疾病,在世界范围内广泛地危害养猪业。PRDC见于不同生产模式的猪场,包括规模化养猪场,对各个日龄段和生产阶段的猪群,包括母猪、哺乳仔猪、保育猪和育肥猪等产生危害。PRDC是一种多因子疾病,在典型的病例中可以检出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪肺炎支原体(MH),猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(H p)等常见几种病原[3]。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的,以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高病死率及育肥猪呼吸道症状为特征的一种病毒病[4-5]。PRRSV可损害感染猪的免疫系统,影响猪对其他疫病免疫抗体的产生,引起其他疫病的免疫失败,常常造成多种病原的并发或继发感染,加剧病情,使病死率增高,给养猪业造成严重的经济损失。我国从1996年首次报道PRRS以来,已有许多省份相继有该病的报道。本病的流行特点及其病原特性,决定了该病一旦在猪群中出现,将很快通过空气和接触及人工授精等途径传播开来,特别是在规模化、集约化、现代化的高密度养猪地区,该病传播尤为迅速,经济损失更为严重。本研究采用RT-PCR方法,对2008年秋季和冬季,云南省滇东、滇西、滇北、滇南和滇中32个规模养殖场无菌采取仔猪、育肥猪、母猪和公猪共552份全血进行了PRRSV检测,以期能从病原学上更准确地了解PRRSV在云南省不同地区猪群中的感染情况,为有效地预防和控制PRRS提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2008年秋季和冬季,在云南省滇东、滇西、滇北、滇南、滇中等地区共32个规模养殖场,以无菌方式采取仔猪、育肥猪、母猪和公猪共552份肝素抗凝全血,于4℃保存。

1.1.2 主要试剂 总RNA抽提试剂T rizol购自Invitrogen公司;M-mLV反转录酶购自Promega公司;RNasin购自华美公司;氯仿、异丙醇等试剂均为分析纯级别。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank公布的美洲型VR-2332 PRRS[6]病毒ORF7基因序列和文献,选择设计扩增核衣壳蛋白基因(N)的上下游引物分别为 P1(5′-AAT GGC ACG CCA GTC AAT CA-3′)和 P2(5′-TCA TGC TAA GGG TGA TGC TG-3′)。预期扩增 PRRSV目的基因片段为304 bp,引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2 病毒总RNA的提取 参照文献[7]进行。根据北京百泰克生物技术有限公司的血液(液体样本)总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取病毒总RNA,提取的RNA样品保存在-20℃或-70℃。

1.2.3 病毒cDNA的合成 根据北京百泰克生物技术有限公司的BioTeke super RT Kit试剂盒说明进行病毒cDNA的合成。

1.2.4 目的基因片段的扩增 PCR反应体系:10×PCR buffer(含 MgC12)5.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL,上、下游引物 P1(10 pm ol/μL)和 P2(10 pm ol/μL)各 1.0 μL,cDNA 4.0 μL,0.5 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL),加dH 2O至50μL。PCR反应参数:95℃3min;95℃1min,57℃1 min,72℃1.5 min,共35个循环;72℃10 min。反应结束后取 5μL PCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,在凝胶成像系统上观察。

2 结果

2.1 血液样品RT-PCR产物的电泳

扩增的基因片段长度在DNA M aker DL 2 000 250 bp与500 bp之间,与预期的304 bp相符,提示扩增产物可能为预期目的条带。将此片段进行序列测定,测序结果表明为正确扩增(图1)。

图 1 PRRSV目的基因PCR扩增结果Fig.1 The result of PRRSV amplified by PCR

2.2 PRRSV流行病学调查结果

用扩增PRRSV ORF7基因片段的引物,对所采血样进行了PRRSV感染的状况调查,结果见表1和表2,从中可以看出,所有受检地区样品中均存在PRRSV感染,平均总阳性率为70.1%(387/552)。在不同生长阶段猪群中,以仔猪带毒的阳性率最高,为78.5%(113/144)。在不同区域猪群中,最高为滇东(73.0%),其次为滇南(72.7%),滇中(72.2%),滇西(67.2%),滇北(65.6%)。秋季比冬季的平均感染率相对偏低,秋季、冬季的平均阳性率分别为64.86%和75.36%。

表1 云南省不同地区猪场秋季PRRSV的PCR检测结果Table1 The resu lts of PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in autumn

表2 云南省不同地区猪场冬季PRRSV的PCR检测结果Table2 The resultsof PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in w inter

3 讨论

近年来,尤其是2006年中期后,PRRS以传播迅速和高发病率、高病死率的流行病学特征在我国广泛流行。本调查从云南省32个规模化猪场采集猪血液样本进行了PRRSV RT-PCR检测,采样范围基本含盖了全省,且本次调查针对不同年龄猪,其所得结果更具有普遍性和代表性。

从不同生产用途分析,公猪PRRSV感染阳性率为76.7%(46/60),母猪 73.4%(102/139),育肥猪60.2%(126/209)。相对而言,公猪阳性率较母猪和育肥猪高。这可能是由于公猪一般不接种PRRS疫苗,PRRSV可以通过精液间断性排出,而没有临床症状或处于亚临床症状[8],公猪的PRRSV感染往往成为猪场疫病防制中容易忽视的环节。因此有必要加强公猪的免疫监测与净化工作,特别注意种公猪的对外引进。此外,对本次PRRSV检测结果为阳性的部分猪场进行跟踪调查,发现检出阳性病料的猪场中多数母猪有繁殖障碍情况,表明PRRSV感染已成为猪场中母猪发生繁殖障碍的主要原因。

斯特劳等[9]报道,各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。本次调查也得到了相似的结果,在不同生长阶段猪群中,仔猪阳性率为78.5%(113/144),母猪73.4%(102/139),较育肥猪60.3%(126/209)阳性率相对要高。

不同季节感染状况调查结果表明,云南省冬季猪群PRRSV感染率相对秋季高。秋季、冬季的PRRSV感染平均阳性率分别为64.86%、75.36%。这可能和云南独特的气候有关。云南气候属亚热带湿润季风气候类型,冬暖夏凉,是各种病毒孳生的温床。

不同区域PRRSV感染调查调查结果表明,云南不同地区PRRS流行情况有一定差异性,其中,滇东最高为73%,其次滇南为72.7%,滇中为72.2%,滇西为67.2%,滇北为65.6%,这表明滇东地区是云南省PRRS的高发地区。这种差异可能与云南地理环境有关。云南气候垂直变化十分明显,而滇东大部分地区属于亚热带和温带地区,这样适宜的气候有利于PRRSV的生存。且东部交通运输便利,人流物流较频繁,很容易形成病毒流通网。

近年来RT-PCR已广泛应用于畜禽传染病的快速诊断。RT-PCR方法一般用于PRRSV组织病料(肺脏)的检测,本试验初步建立了从含毒量较少的血液和精液检测PRRSV的RT-PCR方法,为更有效、经济、快捷的检测PRRSV提供了参考。

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