树干毕赤酵母菌对内醚糖的利用*

代江红，余志晟，王晓燕，张洪勋

1(中国科学院研究生院资源与环境学院，北京，100049)2(北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083)

树干毕赤酵母菌对内醚糖的利用*

代江红1，余志晟1，王晓燕2，张洪勋1

1(中国科学院研究生院资源与环境学院，北京，100049)2(北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083)

研究了树干毕赤酵母菌(Pichia stipitis)对内醚糖的利用及发酵产乙醇的情况。结果表明，与对葡糖糖的利用相比，树干毕赤酵母菌利用内醚糖的效率较低，且不能发酵产乙醇。然而，在内醚糖和葡萄糖同时存在的情况下，内醚糖可促进树干毕赤酵母的生长，乙醇产率也获得提高。在 YPD培养基中添加0.1% 内醚糖，细胞浓度和乙醇产率最高，其中细胞浓度提高14.3%，乙醇产率提高25.4%。

内醚糖，树干毕赤酵母菌，乙醇发酵

利用纤维素生物质生产燃料乙醇，在解决能源问题和环境污染方面有巨大潜力［1－2］。然而由于纤维素结构致密复杂，很难通过酶法将其分解成可发酵的单糖，这阻止了纤维素的乙醇转化［3］。一些研究发现，纤维素在一定的热解条件(高温、缺氧)下可生成以内醚糖(Levoglucosan，1，6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖，简称LG)为主的热解产物［4－5］。而以内醚糖作为微生物的有效底物进行生物转化，无疑为纤维素生物质的乙醇转化提供了一条新途径。

目前，研究人员已从自然界筛选获得了部分能直接同化内醚糖的微生物菌株，并实现了对某些产品的内醚糖生物直接转化，如衣康酸、柠檬酸的生产［6－7］;而且进一步发现不少真菌能通过一种内醚糖激酶催化内醚糖，生成 6-磷酸葡糖，进入糖代谢被利用［8－10］。然而目前已发现的真菌利用内醚糖的效率普遍较低，原因是内醚糖激酶对内醚糖的亲和力较低，Km高达 48～102 mmol/L［11］;另外，现有的酿酒酵母菌很少能利用内醚糖。Prosen［5］等筛选到1株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae NRRL Y132)能直接发酵内醚糖产乙醇，但是对内醚糖的转化率只有葡萄糖的1/3。Nakagawa［6］等筛选了 6株毕赤酵母菌(Pichia spp.)，发现1株能利用内醚糖，但不产乙醇，以及17株酵母菌(Saccharomyces spp.)不能利用内醚糖。本课题组以内醚糖为唯一碳源对中国3大微生物菌种库(CGMCC，ACCC，CICC)的89株菌株进行了内醚糖的同化能力筛选［12］，其中41株为酿酒酵母菌，均无利用内醚糖的能力，筛出的1株具有较强内醚糖同化能力的斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi YZ－215)菌发酵内醚糖时不产乙醇。最近，本课题组分离、纯化了它的内醚糖激酶，并成功克隆、表达了内醚糖激酶基因［13－14］。把内醚糖激酶的氨基酸序列提交到NCBI进行BLASTP检索，发现树干毕赤酵母菌(P.stipitis)有内醚糖激酶基因。这暗示树干毕赤酵母菌能利用内醚糖。

课题组研究树干毕赤酵母菌对内醚糖的单独利用及发酵，以及与葡萄糖的混合发酵，旨为内醚糖作为树干毕赤酵母菌的一种发酵添加剂提供实验依据，进而为内醚糖作为真菌的一种发酵添加剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

树干毕赤酵母菌(P.stipitis NBRC 10063=CBS 6054):购自日本技术评价研究所生物资源中心(Biological Resource Center，National Institute of Technology and Evaluation)。

YPD培养基(g/L):酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖20，琼脂20;液体培养基不加琼脂。

YPLG培养基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，内醚糖20，琼脂20;液体培养基不加琼脂。

发酵培养基(g/L):YPD液体培养基，YPLG液体培养基。

1.2 仪器与设备

UV－4802H紫外分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;高效液相色谱(HPLC):检测器:RID－10A示差检测器;分析柱:Transgenomic ICSep ICE－ORH－801柱(300 mm×6.5 mm)日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 树干毕赤酵母菌对内醚糖的利用实验

树干毕赤酵母菌于YPD平板上活化，然后接种于YPD液体培养基，30℃ 过夜振荡培养。分别在YPD、YPLG固体培养基划线接种，置于恒温培养箱，30℃ 培养2 d后观察菌落生成情况。同时树干毕赤酵母菌按照1% 的接种量分别接种到含有20mL YPD、YPLG的100mL三角瓶中，30℃，200 r/min的恒温摇床上培养。每2 h取样，测定OD值。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制树干毕赤酵母菌的生长曲线。

1.3.2 树干毕赤酵母菌内醚糖发酵实验

活化后的树干毕赤酵母菌接种到YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～17 h，按1% 的接种量接种到含有 20mL发酵培养基的100mL三角瓶中，30℃，130 r/min的恒温摇床上培养。48 h后测乙醇浓度。

1.3.3 内醚糖对树干毕赤酵母菌生长影响的测定

将在YPD液体培养基中活化的菌种，按1% 的接种量接种在 20mL含有不同内醚糖浓度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液体培养基的 100mL三角瓶中，30℃、200 r/min的恒温摇床上培养。每隔2 h测其OD值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制曲线。

1.3.4 内醚糖对树干毕赤酵母菌发酵影响的测定

将在YPD液体培养基中活化的菌种，按照1%的接种量接种在20mL含有不同内醚糖浓度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液体培养基的 100mL三角瓶中，在 30℃、130 r/min的恒温摇床上培养。48 h发酵完毕后测定乙醇浓度。

1.3.5 分析方法

细胞浓度采用分光光度计比色法，用细胞在600 nm的OD值表示。葡萄糖、内醚糖和乙醇的含量采用高效液相色谱(HPLC)。分析样品，每次取样100μL，用微孔滤膜(φ 0.45 μm)过滤培养液，取 10μL滤液进行HPLC分析。流动相采用5 mmol H2SO4溶液，流速0.6mL/min，温度50℃。

2 结果与分析

2.1 树干毕赤酵母菌对内醚糖的利用

培养2 d后，树干毕赤酵母菌在内醚糖培养基(YPLG)的菌落小于在葡萄糖培养基(YPD)上的菌落(没有显示)。这表明，树干毕赤酵母菌可以利用内醚糖，但其利用能力低于利用葡萄糖的能力。图1显示，在液体培养基中，树干毕赤酵母菌在以内醚糖为碳源的培养基中的生长不如在葡萄糖培养基中，细胞浓度明显低于在葡萄糖培养基中的细胞浓度，并且很到达快对数期、稳定期。在稳定期，内醚糖培养基中的细胞浓度大约占葡萄糖培养基中的38%。这说明像其他真菌一样，树干毕赤酵母菌的内醚糖激酶对内醚糖的亲和力较低，Km较高。

图1 树干毕赤酵母菌在葡萄糖和内醚糖液体培养基中的生长曲线

2.2 树干毕赤酵母菌内醚糖发酵实验

尽管树干毕赤酵母菌能利用内醚糖，发酵实验显示内醚糖发酵没有乙醇产生。测定发酵培养基的pH，结果显示YPD培养基在发酵前后，其pH基本保持不变，而树干毕赤酵母菌内醚糖发酵后，培养基的pH由酸性变为偏碱性(表1)。由于乙醇发酵是酸性环境，因此，培养基的 pH改变可能是导致树干毕赤酵母菌内醚糖发酵不产乙醇的原因。

表1 发酵培养基的pH变化

2.3 内醚糖对树干毕赤酵母菌的生长和发酵产乙醇的影响

图2显示，YPD培养基加入内醚糖后，树干毕赤酵母菌的细胞浓度有所提高。当内醚糖的浓度为0.1% 时，细胞浓度最高，提高14.3%。

图3显示，YPD培养基加入内醚糖后发酵，乙醇产率有所提高。添加0.1% 的内醚糖，细胞浓度提高8.3%，乙醇产率最大提高25.4%。内醚糖对树干毕赤酵母菌生长和发酵的影响是一致的，这可能是内醚糖促进树干毕赤酵母菌的生长、细胞数量增加，导致细胞高密度发酵，提高了乙醇产率。值得注意的是，发酵结束后，内醚糖的浓度几乎没有发生变化。

图2 内醚糖对树干毕赤酵母菌生长的影响

图3 内醚糖对树干毕赤酵母菌发酵产乙醇的影响

3 讨论

研究人员一直想筛选到能利用内醚糖发酵产乙醇的酶母菌株，提高纤维素生物质热解产物的生物转化。然而，大多数酿酒酵母菌都不能利用内醚糖，或者利用率较低，能利用内醚糖的酵母菌却不能产乙醇。本课题组克隆到真菌利用内醚糖的内醚糖激酶基因，BLASTP检索发现酿酒酵母菌不含内醚糖激酶基因，而能发酵葡萄糖和木糖产乙醇的树干毕赤酵母菌含有内醚糖激酶基因。然而，实验显示树干毕赤酵母菌可以利用内醚糖，但利用效率较低，且发酵内醚糖不产乙醇。

内醚糖发酵完后，培养基的pH值由酸性变为碱性。培养基的pH值改变可能是导致树干毕赤酵母菌发酵内醚糖不产乙醇的原因。除具有较高的Km之外，真菌内醚糖还具有较高的最适(pH值9.0)，pH 值 7.0 时酶活不到 pH 值 9.0 时的 50%［9，13］。Luyen［15］等人的研究表明，内醚糖可促进微球藻的生长，最高生长量可达150%。本研究也发现内醚糖对树干毕赤酵母菌的生长和发酵产乙醇有一定的促进作用。作者［16］曾提出真菌内醚糖激酶可能是细胞壁的一种周期蛋白。内醚糖很可能是通过诱导内醚糖激酶，导致细胞壁循环代谢相关酶的产生，促进细胞壁的快速循环和细胞生长，提高细胞浓度，造成高密度发酵，从而提高乙醇产率。因此，在利用树干毕赤酵母菌发酵纤维素酸水解产物生产乙醇的过程中，可以考虑添加内醚糖以提高乙醇产率。另外，由于真菌内醚糖激酶对内醚糖的亲和力较低，真菌对葡萄糖的利用明显高于内醚糖，因此，内醚糖是否能作为其它真菌的发酵添加剂值得深入研究。

4 结论

树干毕赤酶母菌可以利用内醚糖，但与葡萄糖相比，内醚糖的利用率低相对均干毕赤酶母菌发酶内醚糖后，培养基的pH值由酸性变为碱性，同时不产乙醇;内醚糖可以促进树干毕赤酶母菌的生长和乙醇产率的提高，在YPD培养基中添加0.1%内醚糖，细胞浓度提高14.3%，乙醇产率提高25.4%。

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Utilization of Levoglucosan by the Yeast Pichia stipitis

Dai Jiang-hong1，Yu Zhi-sheng1，Wang Xiao-yan2，Zhang Hong-xun1
1(College of Resources ＆ Environment，Graduate University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)2(College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

This investigation focused on the utilization and ethanol fermentation of levoglucosan by the yeast Pichia stipitis.Results revealed that P.stipitis could utilize levoglucosan at a low efficiency compared to glucose，and could not ferment it to ethanol.However，levoglucosan could facilitate the growth of P.stipitis and enhance its ethanol production when both levoglucosan and glucose existed in culture media.In YPD media with 0.1%levoglucosan，the enhancement of cell concentration and ethanol production was approximately 14.3%and 25.4%，respectively.The results would support that levoglucosan could be used as an additive in high cell density fermentation with P.stipitis.

levoglucosan，Pichia stipitis，ethanol fermentation

博士，讲师(余志晟副教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(No.20507021);北京市科学技术委员会科技新星项目(2006A2156)

2010－08－01，改回日期:2010－09－27