稀释率对短乳杆菌NCL912连续培养产γ-氨基丁酸的影响

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科学教育部重点实验室南昌大学中德联合研究院，江西南昌，330047)

稀释率对短乳杆菌NCL912连续培养产γ-氨基丁酸的影响

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科学教育部重点实验室南昌大学中德联合研究院，江西南昌，330047)

建立了短乳杆菌(Lactobacillus brevis)NCL912连续培养生产γ-氨基丁酸的方法。在32℃、pH 5.0、150 r/min 条件下，通过考察不同稀释率(0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1和 0.14 h－1)时，连续培养体系中菌体浓度、葡萄糖利用和GABA产量3项指标的变化，研究了稀释率对连续培养的影响。结果表明，当稀释率为0.06 h－1和 0.14 h－1时，培养不能达到稳态;当稀释率为 0.08 h－1、0.01 h－1及 0.12 h－1时，反应体系均能进入稳态。在考察的几个稀释率中，0.10 h－1最好。

短乳杆菌NCL912，连续培养，稀释率，γ－氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种天然存在的非蛋白氨基酸，广泛分布于动植物体内［1］。GABA是哺乳动物中枢神经系统的一种重要抑制性神经递质，具有重要的生理功能［2－7］。

GABA的制备有化学合成法和微生物合成法。相比而言，化学合成法成本高、安全性差;而微生物发酵生产GABA是一种安全、高效、低成本的方法。细菌、酵母以及真菌［8～11］均能发酵生产GABA。其中乳酸菌生产的GABA及其菌体均能直接应用于食品、医药等领域，这就大大增加了其研究开发的意义。利用乳酸菌发酵生产GABA在国内外均有报道［12－17］。但所采用的均是分批发酵技术，目前尚未见有关乳酸菌连续发酵生产GABA的报道。微生物的连续培养(continuous culture)是相对于分批培养而言的。与分批发酵相比，连续培养有其特有的优点，如不需要分批发酵的间隔准备工作，可连续生产，微生物能够维持一个动态的平衡等。因而在动植物细胞和微生物的培养，微生物的生理生化研究，细胞和代谢产物的生产等方面有着广泛应用。

本实验室在前期工作中，筛选出1株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)NCL912［18］，并对其分批发酵合成GABA的工艺进行了研究，确定了分批培养的发酵条件［19］。进一步对短乳杆菌 NCL912连续培养产GABA进行了初步的研究，成功组建了连续培养系统;研究了不同稀释率(dilution rate，D)对乳酸菌连续培养体系的影响，探讨了连续培养技术在GABA生产中的应用。

1 实验材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;高速冷冻离心机，Sigma公司;pH电极，苏州市汉星电化学有限公司;pH控制仪，日本东京B.E.Marubishi有限公司;79－1型磁力搅拌器，上海仪表(集团)供销公司;蠕动泵，兰格恒流泵有限公司;温度控制系统为自己组装，水缸、可控温加热棒等购自市场。

实验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 菌种与培养基

菌种:短乳杆菌(Lactobacillus brevis)NCL912，高产GABA，由本实验室从泡菜中分离并保存［18］。

种子培养基:葡萄糖，25g/L;酵母浸粉，6.25g/L;大豆蛋白胨，6.25g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.15mol/L;吐温80，2mL/L，用2mol/L H2SO4调pH值为5.0，高压灭菌。

连续培养培养基:葡萄糖，30g/L;酵母浸粉，12.5g/L;大豆蛋白胨，12.5g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.5mol/L;吐温 80，2mL/L。培养基的氮源，MSG，以及其他成分分别高压灭菌，121℃，20min，然后混合备用。

1.3 种子活化方法

取保藏菌种接种于5mL种子培养基中，32℃静置培养24 h。按此方法活化2次后，以5%的接种量转接于100mL种子培养基，32℃、150 r/min振荡培养10 h，即为种子培养物。

1.4 连续培养装置图与操作方法

连续培养实验装置如图1所示。

图1 连续培养装置简图

反应器为800mL玻璃罐，工作体积设定为400mL。组装系统并配制培养基，灭菌后，打开蠕动泵往反应器内流加360mL已混合的发酵培养基，用注射器接种40mL种子培养物，pH用pH控制仪自动控制。经过10 h培养，打开蠕动泵以一定稀释率向反应器内流加培养基，开始连续培养。连续培养条件如下:培养温度32℃;搅拌速度150 r/min;pH 5.0，用2mol/L H2SO4溶液自动调控。实验选取5种不同的稀释率，分别为 0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1及0.14 h－1。每12 h取样，测定培养液中的菌体浓度、GABA浓度及残糖浓度。

1.5 培养液样品相关参数检测

菌体浓度:样品稀释5倍后，使用紫外分光光度计测定样品在600 nm波长下的吸光值(A600)。GABA浓度:采用预染纸色谱法测定［20］。残糖浓度:采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)测定。

1.6 连续培养稳态的确定

连续培养进行60 h后，连续3次取样分析，如测定的3种参数指标的波动范围在5%以内，可认为连续培养已经进入稳态。本实验主要依据菌体浓度、GABA浓度及葡萄糖浓度的检测结果，确定连续培养系统是否达到稳态。

1.7 数据分析

本实验数据均采用软件Sigma Plot 10.0分析。

2 结果与讨论

2.1 稀释率对乳酸菌连续培养稳态建立的影响

本实验研究了在不同稀释率情况下，乳酸菌连续培养系统运行状况，实验结果如图2～图6所示。由图2可知，为当稀释率为0.06 h－1时，在前36 h反应体系中葡萄糖含量急剧下降，导致随后培养过程中菌体浓度下降，且GABA浓度不能保持稳定。说明当D=0.06 h－1时，培养基补给速度小于消耗速度，营养不足以维持菌体的生长，致使菌体大量死亡，培养不能进入稳态。图3、图4及图5表明，当稀释率为分别 0.08 h－1、0.10 h－1和 0.12 h－1时，在培养进行到60 h后，反应体系中菌体、GABA浓度及葡萄糖浓度均能在一定水平维持稳定，整个系统达到稳定状态。由图6可知，当稀释率为0.14 h－1时，随着发酵的进行，反应体系中的菌体浓度逐步下降，GABA浓度及葡萄糖浓度有比较大的波动。说明当D=0.14 h－1时，发酵液稀释速率大于菌体增殖速率，菌体不断被洗出，0.14 h－1已接近临界稀释率DC(相当于最大比生长速率μmax时的D值)。

图2 稀释率0.06 h－1时菌体、GABA和葡萄糖的变化

图3 稀释率0.08 h－1时菌体、GABA和葡萄糖的变化

图4 稀释率0.10 h－1时菌体、GABA和葡萄糖的变化

图5 稀释率0.12 h－1时菌体、GABA和葡萄糖的变化

图6 稀释率0.14 h－1时菌体、GABA和葡萄糖的变化

2.2 稀释率对GABA浓度、葡萄糖浓度及GABA产率的影响

当系统达到稳态时，不同稀释率情况下连续培养体系中GABA浓度、葡萄糖浓度及GABA产率如表1所示。

由图7(A)可知，随着稀释率的增大，GABA浓度逐渐降低。GABA浓度在D=0.01 h－1时比D=0.08 h－1时低 9.97%，在 D=0.12 h－1时比 D=0.10 h－1时低14.65%。由图7(B)可知，当稀释率分别为0.08 h－1和0.10 h－1时，反应体系中残余葡萄糖浓度均比较低，分别为0.756 5±0.102 3g/L、1.039 7±0.071 3g/L;当稀释率为0.12 h－1时，残糖浓度大幅增加为16.283 1±0.414 5g/L。说明低稀释率(0.08、0.10 h－1)利于菌体对葡萄糖的充分利用，而高稀释率(0.12 h－1)则会造成大量浪费。由图7(C)可知，GABA产率随稀释率的增大而增加，在D=0.10 h－1时比 D=0.08 h－1时高12.53%，D=0.12 h－1时比 D=0.10 h－1时高2.41%，GABA产率的增加幅度随稀释率的增大而减小，说明高稀释率(D=0.12 h－1)不利于菌体充分发酵生产GABA。综合GABA产率和葡萄糖剩余2个因素，短乳杆菌NCL912连续培养生产GABA选取0.10 h－1的稀释率较为合适。

表1 短乳杆菌NCL912连续培养结果

图7 稀释率对GABA浓度(A)、葡萄糖浓度(B)及GABA产率(C)的影响

3 结论

本研究成功建立了短乳杆菌NCL912连续培养生产GABA的方法，并以连续培养中菌体浓度、葡萄糖利用和GABA产量为指标，考察了不同稀释率对连续培养的影响。当稀释率为0.06 h－1和0.12 h－1时，培养不能达到稳态，而当稀释率为 0.08 h－1、0.01 h－1及0.12 h－1时，反应体系均能进入稳态。随着稀释率的增大，稳态时GABA的产量下降，而产率升高。稀释率为0.08 h－1和0.10 h－1时，发酵液中残糖浓度比较低，菌体对营养的利用比较充分;当稀释率增大为0.12 h－1时，发酵液中则有(16.283 1±0.414 5)g/L葡萄糖残余。实验结果表明，对短乳杆菌NCL912进行连续培养，能够实现GABA的高效连续生产。

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Effect of Dilution Rate on γ-Aminobutyric Acid Production by Continuous Culture of Lactobacillus brevis NCL912

Qiu Ting，Li Hai-xing，Cao Yu-sheng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-Geman Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

A continuous culture method of Lactobacillus brevis NCL912 was developed for production of γ－aminobutyric acid.The effects of the dilution rate on the biomass，residual glucose and GABA yielding of the continuous culture were investigated.The results indicated that dilution rate had a significant effect on the cell proliferation and GABA production.Steady state could not be obtained when dilution rates were 0.06 h－1or 0.14 h－1.When dilution rates were 0.08 h－1，0.10 h－1or 0.12 h－1，the culture system could reach the steady states.Among the dilution rates tested，0.10 h－1was the best one for the GABA continuous production.

Lactobacillus brevis NCL912，continuous culture，dilution rate，γ-aminobutyric acid

硕士研究生(曹郁生教授为通讯作者)。

2010－07－15，改回日期:2010－10－12