玉米赤霉烯酮降解的研究进展

熊凯华 程波财,2 胡 威 汪孟娟 叶若松 魏 华

(食品科学与技术国家重点实验室1,南昌 330047)

(中南大学资源加工与生物工程学院2,长沙 410083)

玉米赤霉烯酮降解的研究进展

熊凯华1程波财1,2胡 威1汪孟娟1叶若松1魏 华1

(食品科学与技术国家重点实验室1,南昌 330047)

(中南大学资源加工与生物工程学院2,长沙 410083)

真菌毒素广泛存在于世界各地的谷物及其副产物当中。玉米赤霉烯酮 (Zearalenone)作为镰刀霉毒素的代表,是影响食物安全的重要因素之一。传统的毒素清除方法包物理和化学方法。物理方法能部分清除毒素,但易破坏食物的营养物质,化学方法随着化学试剂的添加会引入不确定的危害因素。生物降解作为目前的研究热点,可在温和条件下微生物将毒素转化为无毒产物。报道了物理、化学和生物方法清除玉米赤霉烯酮的研究进展,重点对生物降解进行了综述。

玉米赤霉烯酮 真菌毒素 生物降解 清除

食品安全已成为世界各国普遍关注的焦点问题,它不仅涉及到贸易壁垒中的技术问题,而且涉及到从农场到餐桌的食物链安全保障问题。为此,我国科技部先后启动“十五”和“十一五”科技支撑计划,设立“食品安全关键技术”重大专项,针对一些迫切需要控制的食源性危害 (化学性、生物性)进行系统攻关。生物毒素是食源中较为广泛的危害之一,真菌毒素作为影响食品安全的一大类生物毒素,成为科技攻关的核心问题。

玉米赤霉烯酮 (Zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,在欧洲、非洲、亚洲、北美洲、南美洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及农副产品中都检测到 ZEN的存在[1]。ZEN可在玉米中以 11.8 mg/kg的极高浓度出现[2],在燕麦、小麦、大麦和高粱中也被广泛检出。ZEN一般通过污染的作物进入食物链,奶制品、牛肉和羊等制品中的 ZEN最大质量浓度达 21 mg/kg[3],某些食物中 ZEN污染量甚至高达 289 mg/kg[4]。长期以来有关 ZEN污染的报道很多,ZEN危害机体健康的科学实验也有一些详实的报道。尽管 ZEN等真菌毒素会通过食物链在人体或动物体中造成蓄积,但可以借助于一些物理、化学和生物学手段破坏或降低其毒性,而利用生物手段进行真菌毒素的降解则是近年来科技界研究的热点和焦点。目前有关 ZEN生物降解的研究很少,也没有这方面的综述报道,本文将近十年来科学界对 ZEN的清除、转化及生物降解性研究进展进行了综述。

1 玉米赤霉烯酮化学结构及性质

1.1 化学结构

玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌 (Fusarium gra2 minearum)、黄色镰刀菌 (Fusarium culmorum)、克地镰刀菌 (Fusarium crookwellense)等多种镰刀霉菌产生并释放到土壤环境中的真菌毒素[5]。

1962年 Stob从感染了禾谷镰刀菌的发霉玉米中成功分离到具有雌性激素作用的玉米赤霉烯酮。1966年 Urry用经典化学、核磁共振和质谱技术确定了玉米赤霉烯酮的化学结构并正式确定其化学名称为:6-(10-羟基 -6-氧代 -反式 -1-十 -碳烯)-β-雷锁酸 -内酯。自然界中还存在 ZEN的多种衍生物,最常见的两种衍生物为α-玉米赤霉烯酮(α-zearalenol)和 β -玉 米 赤 霉 烯 酮 (β -zearalenone),其衍生结构如图 1[1]:

图 1 ZEN及其两种衍生物的化学结构

1.2 化学性质

ZEN又名 F-2雌性发情毒素,其形成过程与自然界脊椎动物荷尔蒙 (如雌二醇)相似。由于动物都有该类激素受体 (对雌激素化合物有高亲和性),因而最容易受这种真菌毒素的影响[4]。

进入人和动物体内的 ZEN在机体内产生雌激素效应综合症状,包括影响雌性哺乳动物乳房发育、抑制多倍排卵,导致哺乳推迟、外阴阴道炎、连续动情期、假孕、不育等[6]。甚至会导致不孕或流产,胎儿染色体出现异常、畸形和死胎。新生雌性大鼠单次皮下注射实验和小猪喂食实验已经证实了以上生殖毒性和致畸作用[6-7]。除此之外,ZEN还能导致雄性动物睾丸萎缩,精液质量低劣[6]。α-zearalenol的雌激素活性是 ZEN的 10～20倍,而β-zearalenol的雌激素活性则比 ZEN要低许多[4]。

ZEN还具有致癌性,它会显著增加细胞色素CYP1A1酶活性及其 mRNA表达,刺激人类乳腺癌MCF-7细胞的生长,而细胞色素 CYP1A1酶已被证明是乳腺癌形成的病因[8]。同时 ZEN也是人类食道癌发病率增加的病因之一[6]。研究还发现,当机体内 ZEN浓度过高时,小鼠肝细胞的腺瘤和垂体的肿瘤发生机会会明显增加[9]。另外,ZEN对动物体肾脏、肝脏均能产生毒害作用[10]。

鉴于 ZEN污染的广泛性和毒性,世界粮农组织和世界卫生组织制定了 ZEN的每日最大耐受摄入量(Provisional Maximum Tolerable Daily Intake)为0.5μg/kg·bw·d[9]。许多国家也制定了食品中ZEN的限量标准,中国《粮食卫生标准》(GB2715—2005)规定小麦和玉米中的 ZEN不得超过 60μg/kg。

2 ZEN清除方法

ZEN通过饲料、食品加工原料形式进入食物链。为避免 ZEN对人体健康带来危害,一方面需要建立和健全污染监督、监控的机制,另一方面需要研究高效清除的方法。目前清除 ZEN的方法可分为:物理方法、化学方法和生物方法。

2.1 物理方法

物理方法主要包括热处理和吸附剂吸附。热处理是应用较早的一种方法,通常认为温度越高对毒素清除效果越好。120～140℃加压烹饪可除去被污染食物中 73%～83%的 ZEN[11]。水或其他化合物的存在会降低 ZEN的热稳定性,因此大麦粉中 ZEN的分解速度大于 ZEN纯品[12]。

吸附是利用活性炭、皂土等吸附剂的疏水作用来达到不同程度地清除食物中真菌毒素的目的。活性炭是有效的 ZEN吸附剂之一 (每克活性炭能吸附354.2μmol ZEN)[13]。为增强吸附效果,试验尝试着通过适当修饰 (在黏土的表面加上十六烷基三甲基铵)来提高黏土等铝矽酸盐表面的疏水性,从而提高吸附 ZEN的能力[14]或通过加入阳离子表面活化剂十六烷基吡啶鎓和 N,N-二甲基 -N-十八碳酰基苄铵来增加蒙脱石表面吸附 ZEN能力[15]。

2.2 化学方法

1997年 McKenzie等[16]发现,乙腈水溶液中的臭氧在 15 s内可完全清除浓度为 20μg/mL的 ZEN,反应后用 HPLC检测不到 ZEN的存在,并且经紫外、荧光检测,未发现有新产物出现[16]。

传统的物理和化学方法虽然能部分清除真菌毒素,但有着不可避免的缺点:热处理需要的高温破坏了食品或饲料的营养价值,且 ZEN热分解产物的毒性依然未知。黏土和活性炭等是非专一性吸附剂,在吸附 ZEN毒素的同时,也吸附大量食物中的微量营养物质;被吸附剂吸附的毒素,在无法被分解的情况下会造成再次污染;化学试剂的添加会引入不确定的危害因素。

2.3 生物方法

为寻求一种安全、有效的真菌毒素清除方法,20世纪 60年代,开始尝试用生物学资源进行真菌毒素的降解。采用微生物清除食物链中真菌毒素的方法已被科学界所关注,清除过程包括微生物菌体吸附毒素和微生物将毒素代谢为无毒产物。尤其是后者,这种“解毒”性质的降解正是目前生物方法研究的重点。

2.3.1 微生物菌体吸附

酿酒酵母在体外能够清除大量真菌毒素[17]。Bakutis等[18]随后发现酵母细胞壁对毒素具有很好的清除作用,采用的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevi2 sae)、深红类酵母 (Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、发酵地霉酵母 (Geotrichum fer mentans)和马克思克鲁维酵母 (Kluyveromyces ma2 rxianus)都可以使 ZEN的含量显著降低。Niderkorn等[19]模拟自然条件下青贮饲料中的 pH值和菌体密度,发现酵母菌以外的链球菌属 (Streptococci)、肠球菌属 (Enterococci)也能较好地清除 ZEN,德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus R0149)甚至能除去 88%的 ZEN。由于没有检测到降解产物的出现,推测该清除过程可能与细胞壁的吸附有关,胞壁上的β-D-葡聚糖等多糖是细胞壁吸附的主体,疏水作用在其中起着重要作用。热处理或酸处理时,细胞壁多聚糖和肽聚糖的糖苷键或者肽键断裂,使肽聚糖结构变薄而孔径增大,菌体对真菌毒素的吸附能力增加[20-21]。为进一步验证这种吸附作用,El-Nezami等[4]用甲醇来抽提已吸附真菌毒素的菌体细胞,发现甲醇回收了近 50%的 ZEN。

2.3.2 微生物降解

目前,关于生物降解 ZEN毒素的研究比较少,根据其产物类型分为转化或降解,具体归纳为以下几种:

①转化为α-zearalenol。少数乳杆菌 (Lactoba2 cilli)、明串珠菌 (Leuconostoc)可以将 ZEN转化为α-zearalenol,但动物实验证明α-zearalenol的雌激素毒性可达到 ZEN的 10～20倍[4],因此这种方式的转化并不能看作为去毒性的降解[19]。

②转化为α-zearalenol和β-zearalenol。葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)等根霉属菌株和部分丝状真菌及酵母在一定条件下可将 ZEN转化成αzearalenol和β-zearalenol,研究人员同样认为这种转化不能作为解毒作用[22]。但由于β-zearalenol的雌激素活性比 ZEN要低许多[4],Utermark因此认为β-zearalenol衍生物的出现可以看作是一种解毒作用[23]。

③转化为硫酸盐。少根根霉 (Rhizopus arrhizus)可将 ZEN毒素 C-4位的羟基氧化为硫酸根,从而将ZEN转化为硫酸盐,有关该硫酸盐产物的毒性大小目前还没验证[24]。

图 2 ZEN硫酸盐结构图

④降解成二氧化碳或无荧光、无紫外吸收的物质。毛孢子菌属嗜霉菌毒素菌株(Trichosporon myco2 toxinivorans)可在 24 h内将 ZEN降解成二氧化碳或者无荧光和无紫外吸收的代谢物,代谢物中没有检测到α-zearalenol、β-zeatalenol或 ZEN的存在。细胞培养试验显示,该产物对 MCF细胞无雌激素毒性[25],Schatzmayr和Molnar在随后的试验中也分离得到了类似的降解菌株[17-18]。

⑤降解成 1-(3,5-二羟苯基)-10’-羟基 -1’反式 -十一碳烯 -6’-酮。Hideaki分离到粉红螺旋聚孢霉 (Clonostachys rosea IFO7063)菌株,可将ZEN转化为 1-(3,5-二羟苯基)-10’-羟基 -1’反式 -十一碳烯 -6’-酮。该降解产物无任何雌激素活性[6]。由单拷贝基因 zhd101所编码的碱性乳糖水解酶则是粉红螺旋聚孢霉降解 ZEN的功能性蛋白[26],插入失活试验也证明了这一点[23]。

近年,zhd101基因的克隆及相关转基因研究取得了一定进展。zhd101基因被成功克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevi2 sae)中,导入了该片段基因的大肠杆菌在 24 h内可将培养基中所有的 ZEN、α -zearalenol和 β -zearalenol降解成无毒产物[27]。此外,zhd101基因还被导入到玉米中,形成转基因玉米。该转基因玉米在 48 h内可降解溶液中 90%的 ZEN,每克转基因种子可以清除 16.9μg ZEN[28]。

3 展望

随着微生物工程和基因工程技术的飞快发展,越来越多的真菌毒素降解菌株和降解酶会被人们发现,各种潜藏的毒素降解机制也将逐渐为人类所了解和掌握。ZEN水解酶编码基因的获得为真菌毒素的控制提供新的方向,转基因玉米株的构建为未来将真菌毒素阻断在作物收获之前提供全新的思路,而现有的物理化学清除毒素方法将成为历史,多种真菌毒素混合的抗性菌株可能会成为将来科研攻关的方向和重点。

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Research Progress on Zearalenone Degradation

Xiong Kaihua1Cheng Bocai1,2HuWei1WangMengjuan1Ye Ruosong1Wei Hua1
(The State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University1,Nanchang 330047)
(School of Resources Processing and Bioengineering of Central South University2,Changsha 410083)

Zearalenone is the most widely polluting mycotoxin produced by Fusarium for crop.Research pro2 gress of physical,chemical and biologicalmethods in removing zearalenone is reviewed in this paper.The biodegra2 dation methodspresentpotential utilization in the future with their superiority in overcoming the disadvantages such as incomplete degradation of toxin and loss of nutrients due to the physical and chemical treatments.

zearalenone,mycotoxin,biodegradation,remove

Q-1

A

1003-0174(2010)01-0138-05

国家自然科学基金(3086008)

2009-02-26

熊凯华,男,1986年出生,硕士,微生物工程

魏华,男,1966年出生,研究员,博士生导师,食品生物技术