不同酶切方式对乳清蛋白疏水性和乳化性的影响

韩仁娇，刘春红，冯志彪（东北农业大学.食品学院；.应用化学系，哈尔滨150030）

不同酶切方式对乳清蛋白疏水性和乳化性的影响

韩仁娇a，刘春红b，冯志彪b
（东北农业大学a.食品学院；b.应用化学系，哈尔滨150030）

采用不同的蛋白酶对乳清蛋白进行水解，考察了肽键断裂方式对乳清蛋白肽疏水性和乳化性的影响，以及乳清蛋白不同酶解产物的疏水性和乳化性的关系。结果表明：不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解产物疏水性不同，6种蛋白酶解液的疏水性均随水解度的增大而降低，其中以胰凝乳蛋白酶酶解液的疏水性下降的最慢。研究还发现，乳化性随着水解度增加而先升高后下降，以双酶复合酶解液最差。不同蛋白酶水解液的乳化性指数随疏水性指数的降低而升高，乳化性指数与疏水性氨基酸质量分数成正相关。

乳清蛋白；酶解；水解度；疏水性；乳化性

0 引 言

乳清蛋白是干酪加工过程中所产生的副产品，再经过特殊工艺浓缩精制而得到的一类蛋白质。由于其天然结构较大，直接食用利用率较低[1,2]。如果将乳清蛋白经适当的酶解，不仅其相应的功能性质以及机体利用率可得到改善，且酶解后还可以释放出乳清蛋白中包含的多种生物活性序列，使其成为具有特殊的生理活性的片段，进而实现对人体的特殊生理功能，如降胆固醇、抗癌、镇静等[3-6]。本实验采用Alcalase蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、双酶（Alcalase蛋白酶，木瓜蛋白酶）分别对乳清蛋白进行定位水解，并且研究了不同酶解方式对乳清蛋白疏水性和乳化性的影响，以及水解程度与疏水性和乳化性的关系，以进一步拓宽乳清蛋白酶解产物在食品领域的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

乳清分离蛋白 （Whey Protein Isolated,WPI），蛋白质量分数为98%。

蛋白酶（Alcalase蛋白酶），中性蛋白酶（Neutrase），胃蛋白酶（Pepsin），胰蛋白酶（Trysin），胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin），木瓜蛋白酶（Papain）。

大豆油，化学试剂（所用试剂均为分析纯）。

1.2 主要仪器设备

UVmini-1240紫外可见分光光度计；F4500荧光分光光度计；冷冻干燥机（FDU-1100）；高速台式离心机；PHS-3C型pH计；高剪切均质乳化机；氨基酸分析仪A300。

1.3 实验方法

1.3.1 乳清蛋白水解

称取一定量的乳清分离蛋白，按底物质量浓度为50 g/L将其水化，80℃水浴处理15 min，冷却到每种酶最适的温度，用浓度为1 mol/L的氢氧化钠或1 mol/L的盐酸调到反应所需的pH值后加酶，在恒温振荡器中进行水解，水解过程中不断滴加酸或碱使反应体系维持在初始的pH值，反应结束后置于沸水浴中20 min使酶失活，离心取30 mL上清液进行实验，其余水解液冷冻干燥待用。

用Alcalase蛋白酶和木瓜蛋白酶进行的双酶水解，其水解过程为：先在蛋白酶最适的条件下水解，灭活，离心后，取全部上清液，调节到木瓜蛋白酶最适的条件下再进行水解，后续过程同上。

1.3.2 水解度的测定

游离氨基的测定采用邻苯二甲醛（OPA）法测定水解物游离氨基的浓度[7]。

蛋白质量浓度测定采用凯氏定氮法 （参照GB/T 5009.5-2010）。

式中：h为单位质量蛋白质中被水解的肽键的量（mmol/g）；htot为单位质量蛋白质中肽键的总量（mmol/g）；乳清蛋白质htot为8.8 mmol/g。

1.3.3 疏水性氨基酸浓度的测定

参照中华人民共和国专业标准 （GB/T14965-1994）采用自动氨基酸分析仪测定。精确称取20 mg待测样品于特制的水解管中，加入浓度为6 mol/L优级纯盐酸8 mL，抽真空条件下封口，在110℃的烘箱内水解24 h，取出冷却后，小心全部转移至50.00 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，用双层滤纸过滤，取滤液1.00 mL于25 mL小烧杯中，在真空干燥器中蒸干后（约50℃），残留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1.00 mL（pH=2.2）的缓冲液溶解，待仪器测定使用。

1.3.4 表面疏水性的测定

采用ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）荧光探针法[8]，取乳清蛋白的不同酶解液用Folin-酚法测定蛋白浓度，并用同一磷酸缓冲液逐步稀释（浓度约在0.005%～0.1%之间）后，取不同浓度样品的溶液5.00 mL，分别加入50 μL浓度为8 mmol/L的ANS溶液 （采用0.01 mol/L，pH=7.0的磷酸缓冲液配置），振荡，静置3 min，然后测定样品的荧光强度（FI）。本实验中，激发波长λex=338 nm，发射波长λem=496 nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数（So）。

1.3.5 乳化性的测定

取不同酶解方式的乳清蛋白水解液各20 mL，调节至pH=7.0后加入2 mL食用油，25℃下10 000 r/min搅拌1 min制成乳状液；在10 000 r/min下离心5 min，用质量分数为0.1%的SDS溶液将上清夜稀释适当倍数，以SDS溶液作为空白，测定500 nm处吸光度，以乳化性指数EAI表示乳化性；将EAI测定中制备的乳状液在25℃静止10 min，测定其乳化性指数EAI′，以乳化稳定性指数ESI表示乳化稳定性[9]。

乳化性指数

式中：EAI为乳化稳定性指数；ESI为乳化稳定性指数；C为肽液中蛋白质质量；Φ为油相体积（0.0566）；Δt为时间间隔。

2 结果与讨论

2.1 不同酶解条件对水解度的影响

不同蛋白酶水解乳清分离蛋白的水解情况如表1所示。

表1 不同蛋白酶水解乳清分离蛋白的水解度

由表1可见，在每种酶最适宜的温度和pH条件下，双酶（Alcalase蛋白酶与木瓜蛋白酶）对乳清分离蛋白的水解度最大，达到26.57%，其次为Alcalase蛋白酶，水解度达到22.05%，其主要原因是Alcalase蛋白酶属于碱性蛋白酶，乳清蛋白在碱性溶液中的溶解性比较大，在酸性及中性条件下溶解度次之，这样大大提高了酶与蛋白质之间的作用效果。另外，由于酶的种类和来源不同，不同的蛋白酶具有其特定的酶切位点（见表2）[10]，能够特异性地断裂蛋白质的肽键。

由于Alcalase蛋白酶属于非特异性蛋白质肽链内切酶，且其作用底物广泛，能水解所有羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸，而木瓜蛋白酶可以作用于蛋白质和小分子肽段，切断的肽键与Alcalase蛋白酶水解肽键有互补性，因此Alcalase蛋白酶与木瓜蛋白酶联合作用的水解效果优于Alcalase蛋白酶。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和中性蛋白酶的作用位点不及Alcalase蛋白酶广泛，所以其水解效果偏低。另外，由于胃蛋白酶属于酸性蛋白酶，而乳清蛋白在酸性条件下溶解度较低，加之胃蛋白酶仅作用于肽键两端是芳香族氨基酸的肽键，所以其水解效果最差。

表2 不同蛋白酶特定的作用位点

2.2 不同酶切位点对疏水性的影响

不同酶切位点下，水解时间对乳清分离蛋白疏水性指数以及疏水性氨基酸含量的影响分别如图1和图2所示。

由图1和图2可以看出，不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解产物水解度不同疏水性也不同，6种蛋白水解液的疏水性均随水解度的增大而降低，但降低的程度各有不同，其中，胰蛋白酶水解液的疏水性指数随其水解度的增大，降低的幅度最小。Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解液的疏水性指数随其水解度的增大降低的幅度较大。不同酶处理液中疏水性氨基酸质量分数均随水解度的增大而提高；其中，Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解液中疏水性氨基酸质量分数随其水解度的增大升高的较快。这主要是因为不同的酶具有不同的切割位点，切割位点不同，水解后暴露的疏水性氨基酸末端含量不同，Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，主要水解含有苯环结构或类似苯环结构的芳香族氨基酸形成的肽键，随着水解的进行，含苯环结构的疏水性氨基酸末端缓慢暴露，而含苯环的芳香族氨基酸大都是疏水性氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）[11]，其水解产物中疏水性氨基酸的含量自然较高，对于主要酶切位点是碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸、赖氨酸）羧基端肽键的胰蛋白酶而言，其水解产物中疏水性氨基酸含量则较低；另外，随着水解的进行，水解后形成的肽链愈来愈短，空间阻碍较弱，导致肽链通过疏水相互作用发生聚集，使得与荧光探针结合的疏水基团减少，进而导致表面疏水性指数呈下降趋势，在相同时间内，水解程度愈剧烈其疏水性指数下降的趋势愈明显，所以，Alcalase蛋白酶与双酶水解液的疏水性指数下降的幅度较大。另外，在利用ANS荧光探针法测定蛋白水解液的疏水性时，疏水性指数在很大程度上受到蛋白水解物在溶剂中溶解性的影响[12]，乳清蛋白的疏水性水解产物在溶剂或缓冲液中的溶解度不好，不利于荧光探针的渗透，也可能导致其疏水性指数降低。

2.3 不同酶切位点对乳化性的影响

不同酶切位点下，酶解时间对乳清分离蛋白乳化性的影响如图3和图4所示。

由图3和图4可以看出，不同酶解条件下的乳清蛋白水解物，在水解之初，随着水解的进行其乳化性和乳化稳定性都有所提高，但随着水解时间的进一步延长，二者便随之降低；不同酶处理的水解液的乳化性以双酶酶解液最差。其主要原因可能是由于在水解之初，随着蛋白酶水解作用的进行，疏水基团的暴露和端基（-NH2和-COOH）数目增加使电荷数目增加，阻止了油滴的靠近,有利于胶束的形成，进而提高了乳化性和乳化稳定性。但随着水解的进一步进行，蛋白水解液的乳化性随之降低，其主要原因可能是由于水解度的增大，维持蛋白质稳定结构的各种作用力，如氢键、范德华力等受到破坏，加之肽链逐渐缩短，导致其在油水界面的相互作用力减小，乳化球较易破裂，使得乳化能力降低。另外，在水解过程中，随着水解程度的进一步提高，水解物中形成的聚集物会阻碍油-水界面处粘弹性乳化薄膜的形成，增大了油滴聚集的几率，从而使乳化稳定性呈下降趋势[13]。双酶和Alcalase蛋白酶水解液的乳化性之所以偏低主要是由于Alcalase蛋白酶的水解强度较高，能水解所有羧基侧具有芳香族氨基酸或疏水性氨基酸的肽键，水解产物主要以小分子肽或氨基酸为主，小肽虽然在相界面上能自由移动和吸附，但却不能像大分子量的蛋白质一样在界面上可以展开并适应界面张力，所以其乳化性相对较低[14，15]。

2.4 疏水性与乳化性之间的关系

由图1、图2可以看出，6种酶解方式下，随着水解时间的延长，酶解产物的疏水性指数、疏水性氨基酸质量分数以及乳化性指数的变化规律大致相同，所以，选取其中一种酶切方式——胰蛋白酶水解来研究疏水性以及疏水性氨基酸质量分数与乳化性之间的关系，结果如图5和图6所示。

由图5和图6可以看出：乳化性指数随其疏水性指数的降低而升高，这可能是由于经过蛋白酶水解作用的产物会暴露出疏水键或疏水基团，疏水性氨基酸的含量逐渐增大，使水解产物具有表面活性剂的功能，表面活性明显提高，从而有效的降低界面张力；水解度越大，疏水性氨基酸暴露的越多，界面张力越低，越有利于乳化层的形成，其乳化性指数也就越高[16,17]。由于胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的主要酶切位点是疏水性氨基酸的肽键，水解产物中疏水性氨基酸含量都较高，能够很好的维持油水界面处乳化层的稳定性，所以，二者的水解产物乳化性指数也相应较高；其他几种蛋白酶水解产物的乳化性指数虽略低，但是都与疏水性指数呈现负相关趋势，这说明，在酶的作用下，水解产物的疏水性氨基酸质量分数越高，其乳化能力越强。

3 结 论

采用具有不同酶切位点的酶对乳清蛋白进行定位酶解，考察了不同酶对乳清蛋白的水解情况以及不同酶切位点对疏水性、乳化性和乳化稳定性的影响。Alcalase蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶作用于对乳清蛋白的水解效果较好；不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解产物疏水性不同，6种蛋白水解液的疏水性均随水解度的增大而降低，但降低的程度各不相同，其中以酶切位点是疏水性氨基酸肽键的Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解产物疏水性指数随水解度的增大下降的幅度较大。不同酶解条件下的乳清蛋白水解物，在水解之初，随着水解度的增大其乳化性和乳化稳定性有所提高，但随着水解度的进一步增大，乳化性和乳化稳定性便随之降低。在酶的作用下，水解产物的疏水性指数随疏水性氨基酸质量分数的增大而降低，其乳化能力与疏水性氨基酸质量分数呈正相关。

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Effects of enzymatic hydrolysis on hydrophobicity and emulsifying properties of whey protein isolate

HAN Ren-jiaoa,LIU Chun-hongb，FENG Zhi-biaob
（Northeast Agricultural University a.College of Food Science；b.Department of Chemistry,Harbin 150030,China）

The objective of the present study was to investigate the effects of different proteinases on hydrophobicity and emulsifying capacity of whey protein isolate（WPI）,and the relationship of hydrophobicity and emulsifying capacity was discussed.Results indicated that hydrophobicity could be influenced by different proteinases,and could be decreased with the increase of degree of hydrolysis.The sample treated by Chymotrypsin owned the best hydrophobicity.Another phenomenon was witnessed that emulsifying capacity was improved with the increase of degree of hydrolysis at first,but drops gradually,The sample treated by double-enzyme owned the worst emulsifying capacity.The emulsibe index decreased with the increase of hydrophobic index,the emulsible index and the hydrophobic amino acid content present positive related.

whey protein isolate;enzymatic hydrolysis;degree of hydrolysis;hydrophobicity;emulsifying capacity

TQ936.21+1

A

1001-2230（2011）10-0015-04

2011-06-08

韩仁娇（1986-），女，硕士研究生，从事农产品加工方面及贮藏方面的研究。

冯志彪