巴氏消毒乳储存过程中化学与微生物变化

张宏伟，郑冬梅，孔保华

（东北农业大学 食品学院，哈尔滨 150030）

巴氏消毒乳储存过程中化学与微生物变化

张宏伟，郑冬梅，孔保华

（东北农业大学 食品学院，哈尔滨 150030）

通过研究不同储存温度的巴氏消毒乳感官品质、生化指标和微生物数量，来确定影响巴氏消毒乳品质的主要因素。结果表明，在5 d的储存期内，巴氏消毒乳在4℃和8℃储存条件下感官品质变化趋势几乎一样，在12℃储存条件下感官品质下降趋势较4℃和8℃储存条件下快。巴氏消毒乳中脂肪酶的活力、TBARS值和蛋白水解程度均随着储存时间的延长而逐渐升高，SDS-PAGE显示主要蛋白未见明显分解，金黄色葡萄球菌未检出，嗜冷菌的数量逐渐减少，菌落总数呈现对数生长趋势并在储存的第4天达到稳定期。巴氏消毒乳中残存的脂肪酶、蛋白酶和微生物是影响巴氏消毒乳品质的主要因素。

巴氏消毒乳；储存；品质变化

0 引 言

巴氏消毒乳是一种常见的乳制品，巴氏消毒可杀死乳中有害微生物并最大限度地保存其营养物质[1]。常见的嗜冷菌包括假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、克雷伯氏菌属[2]，假单胞菌属和芽胞杆菌属产蛋白酶和脂肪酶在乳制品加工之后还残存活力，并被死亡的菌体释放到乳制品中[3]，有研究表明原料乳中嗜冷菌产生的胞内蛋白酶与UHT奶胶凝有关[4]，蛋白酶的水解作用还使得乳制品变苦涩，严重影响品质[5]。随着冷藏设备的推广，嗜冷菌成为影响乳制品品质的主要因素。许晓曦对哈尔滨地区的原料乳进行研究，研究表明原料乳中特征病原菌为金黄色葡萄球菌[6]。本实验研究不同储存温度条件下巴氏消毒乳的感官品质、生化指标和微生物数量，来确定影响巴氏消毒乳品质的主要因素。

1 实 验

1.1 材料与试剂

新鲜无抗原料乳，冷却到4℃，4-硝基苯酚丁酸盐（SIGMA），D532A标准蛋白分子量蛋白，苯甲基磺酰氟，丙烯酰胺，Tris，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

DELTA 320 pH计，UT-1800紫外可见分光光度计，LG10-24A高速离心机，DK-S24型电热恒温水浴锅，Powerpac Basic Power Supply电泳仪，Mini-Protean Tetra Electrophoresis System电泳槽，GIS2020凝胶成像仪。

1.3 方法

1.3.1 原料乳的巴氏消毒

将原料乳63℃，30 min巴氏消毒。每只灭菌的100 mL三角瓶约分装60 mL巴氏消毒乳。分别放入4，8和12℃的摇床，以80 r/min震荡培养。

1.3.2巴氏消毒乳的感官评定[7]

由10位感官评定人员组成评定小组，感官评定人员有过乳制品加工和感官评定的经验，对乳制品无偏见、评定时味觉正常未使用有气味的化妆品。评价员评定时不能饥饿或过饱，在评定前1 h内不抽烟、不吃东西，仅喝水。待样品恢复至室温时对样品进行感官评定，每只透明塑料杯倒入约30 mL样品并进行随机编号。在测定前首先新鲜巴氏消毒乳样品进行训练。每次评定由每个评定成员单独进行，相互不接触交流，样品评定之间用清水漱口。

具体的评定方法如下：

（1）色泽。取适量样品于统一的透明杯中，在柔和的日光或灯光下观察色泽。呈均匀一致的乳白色或稍带微黄色为7分；均匀一色，但显黄褐色为4分；不均匀的黄褐色1分。

（2）组织状态。轻轻晃动杯子，在柔和的日光或灯光下观察组织状态。 呈均匀的流体、无沉淀、无凝块、无、杂质，无黏稠和浓厚现象，无脂肪上浮现象7分；有少量脂肪上浮现象外基本呈均匀的流体。无沉淀、无凝块、无杂质、无黏稠和浓厚现象，有微量的絮状物沉淀或脂肪上浮4分；有黏稠和浓厚现象，有凝块或分层现象1分。

（3）滋气味和苦涩味。先闻气味，再品尝样品的滋味。具有乳的香味，无其他异味7分；具有乳的香味，略有酸味或臭味4分；有明显的酸味、臭味和异味1分。无苦味7分；有可以觉察的苦味4分，有苦味1分。

（4）总体可接受性。总体可接受行对该样品的接受程度。完全接受7分；不能完全接受4分；厌恶1分。

1.3.3 乳中脂肪酶活力的测定

采用4-硝基苯酚的游离释放法测定[8]。

样品的制作：0.5 mL样品与2 ml浓度为0.05 mo/L（pH=7.6）巴比妥—盐酸缓冲液混匀，37℃条件下水浴15 min，添加50 μL浓度为0.05 mol/L4-硝基苯酚丁酸盐乙腈溶液，混匀后与37℃条件下水浴10 min，加入0.4ml抑制剂（3体积浓度为0.06 mol/L，pH=7.6 EDTA溶液与1体积的0.06 mol/L的PMSF的二甲基甲酰胺溶液混合）和2 ml乳品澄清剂，混匀，37℃条件下水浴3～5 min。

空白管取乳样0.5 mL与2 mL巴比妥—盐酸缓冲液混合，添加抑制剂混合物400 μL，混匀，37℃条件下水浴15 min，加入50 μL 4-硝基苯酚丁酸盐溶液，其它步骤同样品。

测定以空白管作为对照样，将样品管中的混合物置于420 nm波长下，15 min之内读取吸光值A。

1.3.4 巴氏消毒乳中脂肪氧化程度的测定

TBARS的测定参照Sinnhuber的方法[9]，并作适当的修改。取1 mL样品中放入反应管中，再加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸-盐酸溶液，混匀后在沸水浴中反应30 min后，冷却。取5 mL冷却后的反应液样品加入等体积的氯仿，3 000 r/min条件下离心10 min后，在532 nm处读取吸光值。TBARS值以每千克脂质氧化样品溶液中丙二醛的毫克数表示，其计算公式为

式中：A532为溶液的吸光值；9.48为常数。

1.3.5 巴氏杀菌乳蛋白水解度的测定

使用蛋白水解度（DH）表示：采用邻苯二甲醛法即OPA试剂法。参照Church[10],和管军军[11]的方法改进。准确称取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中,分别加入质量分数20%的SDS 2.5mL，浓度为0.1 mol/L的硼砂25 mL及100 μL β-巯基乙醇,最后用蒸馏水定容到50 mL制成OPA试剂。测定时，取OPA试剂4 mL于试管中，加入200 μL乳样，混匀后于室温反应20 min，在340 nm下测其吸光值。用水代替样品，其他步骤同样品制作空白。

1.3.6 SDS-PAGE

参照Kong的方法[12]，使用的浓缩胶的质量浓度为120 g/L，分离胶的质量浓度50 g/L，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V。

1.3.7 巴氏消毒乳的pH值测定

使用pH计测定不同贮藏温度和不同贮藏时间下的样品的pH值。

1.3.8 乳中微生物的测定

（1）嗜冷菌菌数的测定[13]，采用BS ISO 17410-2001方法检验嗜冷菌菌落总数。

（2）菌落总数的测定[14]，采用GB/T4789.2-2003方法检验菌落总数。

（3）金黄色葡萄球菌菌数的测定[15]，采用GB/T 4789.10-2003方法检验金黄色葡萄球菌数。

1.3.9 统计分析

每个实试验重复3次，结果表示为平均数±SD。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 巴氏消毒乳的感官评定结果

乳的色泽在消毒前后感官指标没有显著地区别，由于加热使得乳的香味更加浓厚，使得消毒后乳的滋气味要好于原料乳，但是差距不是很显著。在4℃和8℃储存条件下在第1，2和3天感官指标基本没有发生显著地变化，第4天的滋气味发生显著的劣变，苦涩味也开始被觉查出来，第五天乳的色泽发生可观察到的变化，其他各项指标继续变差，样品总体可接受性显著下降（见表1和表2）。

由表3可以看出，12℃储存条件下在第3天苦涩味可以被明显的觉查出来，其他指标变化并不显著，第4天的滋气味发生显著的劣变，苦涩味也更加明显，样品总体可接受性显著下降，第五天乳的各项指标均发生显著的劣变。在可见随着储存温度的升高，乳的感官品质会加速劣变。巴氏消毒乳的总体可接受性也随着储存时间的延长而降低，在4℃和8℃储存条件下下降趋势几乎一样，12℃储存条件下巴氏消毒乳的感官品质的下降趋势较4℃和8℃储存条件的要快。

表14 ℃储存条件下巴氏消毒乳的感官评定得分

表28 ℃储存条件下巴氏消毒乳的感官评定得分

表312 ℃储存条件下巴氏消毒乳的感官评定得分

2.2 巴氏消毒乳的脂肪酶活力变化

图1为巴氏消毒乳中脂肪酶的活力变化结果。图1中，同一列字母中，在同一温度的不同组之间，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著（P＜0.05）。下同。

由图1可以看出，原料乳中脂肪酶的活力在巴氏消毒后明显下降，巴氏消毒乳中脂肪酶的活力随着储存时间的延长逐渐升高，在8℃和12℃储存条件下，在第3天时酶的活力明显上升，在4℃储存条件下，在第3天时酶的活才明显上升。在5 d储存过程中脂肪酶活力随着储存时间的延长和储存温度的升高而升高。Matta和Punj[3]的研究表明假单胞菌属和芽胞杆菌属的蛋白酶和脂肪酶生产乳和乳粉的加热工序后还有活力，当菌体被杀死后释放到液体奶中。脂肪酶的活力的不断增强，使得乳脂肪被分解的可能性越大，被分解的数量越多，使得乳中短链脂肪酸增多，乳的风味变差。

2.3 乳中脂肪氧化程度的测定

由于乳品中约含有质量分数为3.5%的脂肪，因此TBARS值可作为乳品氧化程度的一个重要指标。图2为巴氏消毒乳中脂肪氧化程度的变化。由图2可以看出，乳的TBARS值在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加热造成部分脂肪和蛋白氧化造成。巴氏消毒乳TBARS值随着储存时间的延长和储存温度的升高呈现逐渐升高的趋势。8℃和12℃储存条件的样品在第2天时TBARS值明显上升，在4℃储存条件下在第4天时TBARS值才明显上升。在5 d储存过程中TBARS值随着储存时间的延长和储存温度的升高而升高，在TBARS值显著升高以后，TBARS值变化较为稳定，可知，在5 d的储存期内4～12℃储存条件下，乳脂肪虽然可以被氧化，但是只是一定程度上的氧化。

2.4 巴氏杀菌乳中蛋白水解程度

2.4.1 乳蛋白水解度的变化

图3为巴氏消毒乳中蛋白水解度的变化。由图3可以看出，乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加热造成部分蛋白水解造成乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，巴氏消毒乳中蛋白水解度随着储存时间的延长逐渐升高，在1～2 d的时候上升最明显。

乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加热造成部分蛋白水解造成乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，巴氏消毒乳中蛋白水解度随着储存时间的延长逐渐升高，在1～2 d的时候上升最明显。

一般来说，蛋白分解可能有两种途径：一个是水解，包括酶或酸的水解，一个是剧烈的处理使得蛋白的主链的基团损坏。Meltretter等人[16]的研究认为，原料乳热处理后由酪蛋白分解产生5种新的小肽，在4℃条件下储存时，这些小肽没有变化，而在室温储存条件下，由于蛋白酶的酶解作用使得一个小肽明显增多。

感官评定结果表明，在4℃和8℃在储存的巴氏消毒乳在第4天苦涩味也开始可以被觉查出来，12℃储存条件下的巴氏消毒乳在第3天苦涩味开始可以被明显的觉查出来，这种可以觉察的苦味。牛乳中的大多数蛋白酶不易被牛乳加工过程中的热处理破坏，而且处理后仍然具有活性[17]，苦味可能是残存的蛋白酶对乳蛋白的水解产生了一些呈苦味的肽，在温度较高的条件下蛋白酶对蛋白的分解能力较强，使得12℃储存条件下的巴氏消毒乳在第3天就有苦味。

2.4.2 SDS-PAGE

图4为巴氏消毒乳的SDS-PAGE电泳结果。图4（a）（b）（c） 表示4，8，12℃储存的巴氏消毒乳的SDSPAGE电泳结果。图4中，Ⅰ为标准分子量蛋白，Ⅱ为原料乳，Ⅲ为巴氏消毒乳，Ⅳ为巴氏消毒乳储存2 d，Ⅴ为巴氏消毒乳储存3 d，Ⅵ为巴氏消毒乳储存4 d，Ⅶ为巴氏消毒乳储存5 d。α3-酪蛋白分子量为23.5 ku，β-酪蛋白分子量为24 ku，κ-酪蛋白分子量为19 ku；α-乳白蛋白分子量为14 ku，β-乳球蛋白分子量为18 ku；血清白蛋白分子量为66 ku[18]。

在4～12℃储存温度条件下，各个主要蛋白只是轻微的分解，或者有从电泳中看不出的分解。可以得出结论：巴氏消毒乳在4～12℃储存温度条件下储存5 d未见明显的主要蛋白分解。大多数嗜冷菌产生的蛋白水解酶优先攻击酪蛋白然后才攻击乳清蛋白，而且β-酪蛋白和κ-酪蛋白比αs-酪蛋白更为敏感[19]，但是在电泳图中没有发现各个蛋白的显著分解，但是乳蛋白的水解度却上升并在储存的第4天巴氏消毒乳就可以产生可以觉察的苦味，可以推断蛋白酶水解蛋白的程度较小，因此在SDS-PAGE没有明显的体现。

2.4.3 巴氏消毒乳的pH值变化

图5为巴氏消毒乳pH值变化。由图5可以看出，乳的pH值在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加热造成部分蛋白水解分离出NH2-造成乳的pH值上升。在4～12℃储存条件下在巴氏消毒乳pH值随着储存时间的延长呈现逐渐升高的趋势，在较高的储存温度条件下储存的巴氏消毒乳pH值升高的较慢，而且最终的pH值较低温储存的低。这是由于原料乳的低温储存使得嗜冷菌成为优势菌，虽然大多数嗜冷菌可以被巴氏消毒杀灭，但是当菌体被杀死后其产生的耐热蛋白酶被释放到液体奶中[3]，仍然使得蛋白被分解，产生NH2-造成乳的pH值略有上升，而且在低温条件下，乳酸菌的生长受到抑制，不易产酸，但是在稍高的储存温度下，乳酸菌的生长代谢使得乳的pH值降低。

2.5 巴氏消毒乳中微生物的变化

2.5.1 嗜冷菌菌数的变化

图6和图7分别为不同储存温度条件下嗜冷菌菌数的变化和菌落总数的变化。嗜冷菌的数量在巴氏消毒后立即减少3个数量级，这是由于嗜冷菌大多不耐热，可以被巴氏消毒杀灭。在后续的培养中，嗜冷菌的数量逐渐减少，直至检测不出，可见巴氏消毒对嗜冷菌的杀灭效果很好。

2.5.2 菌落总数的变化

菌落总数在巴氏消毒后立即减少接近3个数量级，这是由于不耐热的微生物被杀灭的原因。在后续的培养中，菌落总数呈现对数生长的状态，可见巴氏消毒对乳中的耐热微生物和芽孢杀灭效果很差，一些耐热的微生物在没有竞争的条件下，在较低的温度下也可以缓慢的生长。由于乳的pH值略有上升，可以推断产酸的乳酸菌在4～12℃储存的巴氏消毒乳中被抑制。

2.5.3 金黄色葡萄球菌菌数的变化

原料乳中的金黄色葡萄球菌菌数为4 300 mL-1，经过巴氏消毒后，在巴氏消毒乳中未检出金黄色葡萄球菌，并且在试验储存期间也未检出金黄色葡萄球菌，这是由于金黄色葡萄球菌不耐热而且无芽孢，能够被巴氏消毒杀灭。金黄色葡萄球菌是乳中重要的致病菌，据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒33%，加拿大则高达45%，由此而造成的经济损失也相当惨重[20]。试验证明巴氏消毒对金黄色葡萄球菌杀灭效果很好，只要消毒后灌装过程没有污染金黄色葡萄球菌，就可以保证巴氏消毒乳的安全。

冷藏储存的牛乳中选择性生长嗜冷微生物（Psychrotrophic microorganisms）。在随后的原料乳巴氏消毒或其他处理过程中杀灭或去除这些微生物，萌发的芽孢或再污染仍然会导致品质的劣变。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素耐热，但是在冷藏条件下金黄色葡萄球菌很难产毒。因此，加工之前嗜冷菌产生的耐热的细胞外的蛋白水解酶和脂肪酶是造成乳制品贮存期间酸败的主要因素，当原料乳中含有5.5 mL-1（对数值）的嗜冷菌时，制成的巴氏消毒乳就容易产生苦味[21]，这就使得微生物代谢产的耐热酶成为影响乳制品品质的重要因素。

3 结 论

用来制作巴氏消毒乳的原料乳的质量对巴氏消毒乳的品质和储存品质有重要的影响，原料乳中的嗜冷菌和金黄色葡萄球菌可以被杀灭，但是嗜冷菌产脂肪酶和蛋白酶对热稳定，会对乳的品质有很大的影响，由于巴氏消毒对乳中的耐热微生物和芽孢杀灭效果很差，因此推荐使用菌数较低的原料乳来加工巴氏消毒乳。巴氏消毒乳在4～8℃储存时，储存3 d，感官未见异常且各项理化指标正常，在12℃储存时，在第3天品质明显下降，建议巴氏消毒乳储存在8℃以下，在4 d之内饮用。

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Chemical and microbiological changes of pasteurized milk during storage

ZHANG Hong-wei,ZHENG Dong-mei,KONG Bao-hua
（Food Department of Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China）

The sensory quality,biochemical targets and the amount of microorganism were studied in order to confirm the main factors affect ing pasteurized milk.The result indicated that the changing trend of the sensory quality was almost the same under the storage condition at 4℃and 8℃during the 5 day storage period,while the sensory quality decreased fast under the storage condition at 12℃compared with the former（4℃and 8℃）.The activity of lipase,TBARS value and the degree of proteolysis were increasing with the prolonging of the storage time in the pasteurized milk.SDS-PAGE showed there was no conspicuous decomposition in the main proteins.Staphylococcus aureus was not detected and Psychrophiles reduced.The total number of bacterial colony presented a logarithmic tread,and then came up to the stationary phase at the forth day during the storage period.So the remaining lipase,protease and microorganism residues were major factors affecting the quality of pasteurized milk.

Pasteurized Milk;Storage;Quality Change

TS252.2+6

A

1001-2230（2011）10-0027-05

2011-03-16

张宏伟（1982-），男，硕士，研究方向为畜产品加工。

郑冬梅