结核分枝杆菌诱导小鼠树突状细胞凋亡及caspase-3、-8活化对凋亡的影响

朱逢佳，姚扬伟，徐水凌，叶伟琴，蔡玉节

结核分枝杆菌诱导小鼠树突状细胞凋亡及caspase-3、-8活化对凋亡的影响

朱逢佳1，姚扬伟2，徐水凌1，叶伟琴1，蔡玉节1

(1.嘉兴学院医学院病原生物学教研室，浙江嘉兴314001;2.嘉兴市第二医院呼吸科，浙江嘉兴314000)

目的：研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)诱导小鼠树突状细胞株(DC 2.4)凋亡及caspase-3、-8活化对凋亡的影响。方法：建立小鼠树突状细胞DC 2.4的人结核分枝杆菌H37Rv细胞混合培养模型。采用DAPI荧光染色法和透射电镜分析凋亡DC 2.4细胞的形态特征;通过DNA琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段化分析，FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测DC 2.4细胞凋亡情况;分光光度法检测H37Rv诱导DC 2.4细胞凋亡过程中caspase-3、-8活性变化。结果：H37Rv与DC 2.4细胞混合培养2 h后，即有细菌侵入，培养4、6、8、10、12 h后，细菌侵入现象更明显，侵入率分别为(16.1 ±4.3)%、(35.8 ±5.1)%、(50.2 ±5.7)%、(58.3 ±6.2)%和(65.9±6.9)%。H37Rv与DC 2.4细胞混合培养6 h后，DAPI染色荧光显微镜、透射电镜观察均发现DC 2.4细胞发生凋亡并出现典型的凋亡特征——染色质浓缩及边缘现象;DNA琼脂糖凝胶电泳出现特征性的凋亡条带。H37R与DC 2.4细胞混合培养6 h、12 h和24 h后，细胞凋亡率分别为(6.4 ±2.5)%，(11.8 ±5.3)%和(31.1 ±8.7)%。caspase-3、-8 活性增高，caspase-3 活性于10 h达高峰(2.01 ±0.09)U/μg，而 caspase-8 活性则在 6 h 达高峰(2.40 ±0.07)U/μg，两者与对照组相比均具有统计学意义(P＜0.05)，且caspase-8激活先于caspase-3。结论：结核分枝杆菌可诱导树突状细胞发生凋亡，其诱导凋亡的机制可能与caspase-3、-8活化有关。

树突状细胞;细胞凋亡;结核分枝杆菌;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

［J Zhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(5):515-521.］

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的一种严重威胁人类健康的传染病，已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。目前，随着Mtb耐药菌株的不断增加以及HIV与Mtb的双重感染，使结核病控制形势更趋严峻［1］。由于Mtb属胞内寄生菌，其产生的免疫主要以细胞免疫为主，树突状细胞(dendritic cell，DC)作为主要的抗原递呈细胞，在机体抗结核病保护性免疫中起着重要的作用，深入了解Mtb感染机体过程中树突状细胞是否发生凋亡、凋亡发生的时机及机制，对进一步阐明结核病的免疫发生机制和为结核病治疗提供新方法具有重要意义。本研究建立了小鼠树突状细胞株DC 2.4的结核分枝杆菌混合培养模型，采用DAPI荧光染色法和透射电镜分别观察Mtb与DC 2.4细胞株混合培养后细胞的核型变，DNA琼脂糖凝胶电泳分析感染后的DC 2.4细胞株的凋亡情况，分光光度法检测Mtb诱导DC 2.4细胞株凋亡过程中caspase-3、-8的活性变化，以期了解结核分枝杆菌诱导树突状细胞的凋亡状况及相关信号途径。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞株及主要试剂 结核分枝杆菌标准菌株H37Rv株(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)由浙江大学医学院病原生物学教研室惠赠;小鼠树突状细胞株DC 2.4由浙江大学免疫研究所惠赠，本实验室常规培养并保存。RPMI1640细胞培养液购自美国Gibco公司;胰酶(trypsin)购自美国Invitrogen公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青生物制品有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Ameresco公司;细胞凋亡DAPI染色试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、caspase-3、-8分光光度法检测试剂盒，均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 细胞培养和H37Rv株悬液制备 将小鼠树突状细胞DC 2.4置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，每2～3 d传代1次。H37Rv株接种于改良罗氏固体培养基，经37℃孵育3周后，挑取生长良好的H37Rv株于磨菌器中，加入含体积分数为0.05%Tween-80的生理盐水研磨15 min，无菌PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗2次，2 500 r/min 离心10 min;然后，将其重悬于不含抗生素的RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)，调整其细菌密度为5.2 ×107CFU/ml，备用。

1.3 H37Rv与DC 2.4细胞株混合培养 取12孔细胞培养板，每孔置一盖玻片(0.8 cm×0.8 cm)，分别接种 DC 2.4 细胞(5.0 ×105个/ml)各 1 ml，于 37℃、5%CO2培养箱孵育。吸弃培养液，每孔加入2 ml RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，无抗生素)，分别孵育2 h。小心吸弃培养液，按细菌∶细胞=100∶1的比例，每孔加入 H37Rv悬液 1 ml(浓度为 5.2×107CFU/ml)，37℃分别孵育0、2、4、6、8、10 和 12 h时，用PBS冲洗3次，取出盖玻片，以-20℃预冷的细胞固定液固定 3 min，PBS洗 2次，Giemsa染色、封片，在光学显微镜下观察。同时，于混合培养的 0、2、4、6、8、10 和 12 h，去除细胞培养板上的细胞培养液，每孔加入250μl 0.1%Triton X-100，于 37℃ 裂解细胞，倒置显微镜下观察DC 2.4细胞的裂解情况，待细胞全部裂解后每孔加入RPMI1640细胞培养液(含10%胎牛血清，无抗生素)500μl终止裂解，混匀后每孔分别做1∶10和1∶100稀释，并接种于罗氏培养基，37℃恒温培养18 d，计数各时间点H37Rv菌落总数(CFU)，同时计算不同培养时间的细菌侵入率。细菌侵入率(%)=不同培养时间的H37Rv菌落总数 /培养前H37Rv菌落总数 ×100%［2］。

1.4 DAPI染色和透射电镜观察H37Rv诱导DC 2.4细胞凋亡 按上述培养方法，于混合培养0、2、6、12、24 h 时，小心取出盖玻片，PBS 洗3次，4% 多聚甲醛固定 15 min，再用 0.1%Triton X-100破膜30 min，加入10μl DAPI和150μl 1%BSA/PBS混匀液，37℃恒温箱孵育40 min，丙三醇/PBS封片，在荧光显微镜下观察DC 2.4细胞核形态改变。于各混合培养时间点，小心刮下与人H37Rv悬液混合培养的DC 2.4细胞(2 500 r/min 离心 10 min)，弃上清，沉淀物用2.5%(V/V)戊二醛4℃固定2 h，PBS洗3次，饿酸再固定，丙酮脱水，树脂包埋，超薄切片后铅铀染色，透射电镜下观察DC 2.4细胞凋亡的核型变化。

1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 收集上述混合培养时间点的 DC 2.4细胞，各约5.0×105个，经PBS洗涤后，按凋亡细胞DNA Ladder检测试剂盒提供的操作步骤提取细胞总DNA。2%琼脂糖凝胶在100 V下电泳约1.5 h，凝胶成像分析仪观察并记录结果。

1.6 流式细胞术定量检测细胞凋亡 收集上述混合培养时间点的DC 2.4细胞，PBS洗3次，然后分别用Annexin V FITC和Propidium iodide(PI)染色，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明书，用流式细胞仪检测各时间段的细胞凋亡情况。实验中设置未与H37Rv悬液混合培养的DC 2.4细胞为对照。

1.7 caspase-3和caspase-8活性检测 按上述方法收集与H37Rv混合培养的DC 2.4细胞和对照组细胞(各约为5.0×105个，于50μl冷冻裂解缓冲液中，按caspase-3、-8分光光度法检测试剂盒说明书操作。各组样品加样至96孔培养板，全自动酶标仪测A405nm值，检测波长为405 nm时caspase-3、-8的活性变化(酶活性以U/μg表示)。

1.8 统计学处理 实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以¯x±s表示，多组间数据比较采用方差分析，细胞侵入率比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H37Rv与 DC 2.4混合培养 H37Rv与DC 2.4细胞混合培养2 h后，即有细菌侵入，侵入率为(8.7 ±1.1)%，培养4、6、8、10 和12 h 后，DC 2.4 细胞的侵入率分别为(16.1 ±4.3)%、(35.8 ±5.1)%、(50.2 ±5.7)%、(58.3 ±6.2)%和(65.9±6.9)%，与混合培养2 h相比较，差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。混合培养组可见H37Rv黏附于细胞表面，有部分H37Rv侵入细胞内，细胞内可见中毒颗粒，随着混合培养时间延长，此现象更加明显(图1)。

表1 H37Rv对DC 2.4细胞的侵入率Table 1 Invasion rates of DC 2.4 cell lines induced by H37Rv(n=4，¯x±s，%)

图1 人结核分枝杆菌H37Rv与DC 2.4细胞混合培养结果Fig.1 Effects of H37Rv strain co-cultured with DC 2.4 cells

2.2 DAPI染色和透射电镜观察结果 DAPI染色结果显示，H37Rv与DC 2.4细胞混合培养6 h后，DC 2.4细胞核逐渐出现固缩，染色质聚集、边缘化等典型的细胞凋亡核形态学改变，且随着培养时间的延长，细胞凋亡核形态学改变越明显;而对照组DC 2.4细胞核呈淡蓝色的圆形或椭圆形，染色质无浓缩及波纹状出现(图2)。透射电镜也发现，未经混合培养的DC 2.4细胞胞核较大，胞核染色质分布均匀，无染色质集聚现象;而H37Rv与DC 2.4细胞混合培养24 h后，DC 2.4细胞胞核体积变小，染色质呈高度凝聚、边缘化(图3)。

图2 人结核分枝杆菌H37Rv诱导DC 2.4细胞凋亡荧光显微镜观察Fig.2 Apoptosis of DC 2.4 cells induced by H37Rv under fluorescence microscopy

图3 H37Rv诱导DC 2.4细胞凋亡透射电镜观察Fig.3 Apoptosis of DC 2.4 cells induced by H37Rv under TEM

2.3 DC 2.4细胞凋亡的DNA片段化分析DNA琼脂糖凝胶电泳分析表明，对照组细胞和混合培养2 h细胞，未见有特征性的DNA梯状条带(DNA Ladder)出现;而 H37Rv与 DC 2.4细胞混合培养6、12、24 h后，DNA降解成特征性的梯状条带;且随培养时间延长，DNA梯状条带逐渐明显(图4)。结果显示H37Rv混合培养6 h时，即可诱导DC 2.4细胞发生凋亡。

2.4 流式细胞术检测DC 2.4细胞的凋亡 流式细胞仪结合Annexin V-FITC标记法检测发现，H37Rv与 DC 2.4 细胞混合培养 2、6、12、24 h后，细胞凋亡率分别为(4.6 ±1.8)%、(6.4 ±2.5)%、(11.8 ± 5.3)% 和(31.1 ± 8.7)%，其中H37Rv混合培养6、12、24 h组凋亡率显著高于对照组(2.8 ±1.1)%(P ＜0.05，图 5)。

图4 H37Rv与DC 2.4细胞混合培养的DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 DNA agarose gel electrophoresis analysis of H37Rv co-cultured with DC 2.4 cells

2.5 caspase-3、-8活性变化 H37Rv与 DC 2.4细胞混合培养6 h后，caspase-3活性开始增高，于10 h 达高峰(2.01 ±0.09)U/μg ，随后逐渐下降;而caspase-8活性则在H37Rv混合培养4 h 后，即达高峰(2.40 ±0.07)U/μg，此后，caspase-8活性逐渐下降。与对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05，表2)。

3 讨论

图5 不同培养时间DC 2.4细胞的细胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rates of DC 2.4 cells induced by H37Rv

作为胞内寄生菌的结核分枝杆菌，可通过其胞壁上的特殊脂质、糖脂和多糖组成的附加层，以及脂质阿拉伯甘聚糖和阿拉伯半乳糖等细胞壁成分，长期存活在宿主巨噬细胞中，并诱导巨噬细胞发生凋亡或坏死。研究表明，诱导宿主细胞凋亡是不少病原微生物重要的致病机制，Mtb侵入宿主的巨噬细胞后，巨噬细胞并不是立即坏死，而是出现细胞凋亡［3-5］。体外实验也证实，被Mtb感染的巨噬细胞可以发生凋亡，且不同毒力的Mtb在不同的感染时间显示出诱导凋亡的能力也有所不同，从而提示巨噬细胞是结核分枝杆菌的主要抗原递呈细胞及杀灭胞内细菌的效应细胞［6］。树突状细胞作为体内重要的抗原递呈细胞，在抗结核免疫中起着始动者作用，Mtb是否侵入宿主的树突状细胞，以及能否诱导树突状细胞发生凋亡，值得深入研究。我们的研究发现，H37Rv与DC 2.4细胞混合培养2 h后，即见有H37Rv的侵入，且随着培养时间的增加，细菌侵入率也随之增高。DAPI染色和透射电镜结果显示，当H37Rv与DC 2.4细胞混合培养6 h后，DC 2.4细胞核逐渐出现固缩，染色质聚集、边缘化等典型的细胞凋亡核形态学改变;DNA琼脂糖凝胶电泳分析表明，H37Rv与DC 2.4细胞混合培养6 h后，DNA降解成特征性的梯状条带;流式细胞仪结合Annexin V-FITC标记法检测结果也显示，H37Rv与 DC 2.4 细胞混合培养6，12，24 h 后，细胞凋亡率分别为(6.4 ±2.5)%，(11.8 ±5.3)%和(31.1 ±8.7)%，细胞凋亡率显著高于对照组的(2.8±1.1)%(P ＜0.05)。从而提示，H37Rv在与DC 2.4细胞混合培养早期，即可诱导树突状细胞发生凋亡。我们推测，这种在混合培养早期即产生的凋亡作用，可能对有效地控制Mtb在胞内的生存、繁殖和扩散有着重要的意义。有研究表明，结核分枝杆菌可通过菌体表面的19 kD脂蛋白，特异性地与巨噬细胞膜表面的Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)结合，从而触发巨噬细胞发生凋亡［7］。结核分枝杆菌对树突状细胞是否也具有相同的作用，尚需进一步证实。

表2 H37Rv与DC 2.4细胞混合培养不同时间段caspase-3、-8活性变化Table 2 Effects of H37Rv on activities of caspase-3 and-8 in DC 2.4 cells at different time(n=4，¯x±s，U·μg-1)

众所周知，细胞凋亡过程中，caspase家族的激活起着关键作用。caspase家族蛋白属于丝氨酸/半胱氨酸家族，存在于细胞浆中，组成细胞凋亡级联信号传导通路。caspase一般以无活性的蛋白酶原形式存在，在蛋白酶水解被激活后会启动凋亡事件的发生［8-9］。通常将caspase家族分为细胞凋亡的起始者(caspase-2/-8/-9)和执行者(caspase-3/-6/-7)，且两者之间存在着上下游关系，即起始者活化执行者。caspase-8与caspase-3在caspase级联反应中分别在起始者与执行者上处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键及凋亡信号传导的共同通路。本研究发现，当H37Rv与DC 2.4细胞混合培养4 h后，caspase-3活性即开始增高，于10 h达高峰;而caspase-8活性则在H37Rv混合培养6 h后，即达高峰，此后逐渐下降。由此我们推测，人型结核分枝杆菌H37Rv菌株诱导DC 2.4细胞发生的凋亡，可能是通过先活化caspase-8，继而再活化caspase-3来完成的。至于其凋亡的具体信号传导机制，还有待于进一步的研究。

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Effects of Mycobacterium tuberculosis on apoptosis of mouse dendritic cells and activation of caspase-3，caspase-8

ZHU Feng-jia，YAO Yang-wie，XU Shui-ling，YE Wei-qin，CAI Yu-jie(Department of Medical Microbiology and Parasitology，Medical School of Jiaxing College，Jiaxing 314001，China)

Objective:To investigate the effects of Mycobacterium tuberculosis on apoptosis of mouse dendritic cells(DC 2.4)and the activation of caspase-3，caspase-8.Methods:Mycobacteriumtuberculosis H37Rv strain was co-cultured with DC 2.4 cells.The morphological changes of DC 2.4 cells were observed with fluorescence microscope after DAPIstaining and transmission electron microscope.The apoptosis of DC 2.4 cells were examined by DNA agarose gel electrophoresis.The activities of caspase-3 and caspase-8 were detected by colorimetric assay.Results:Bacterial invasion was observed while DC 2.4 cells and H37Rv were co-cultured for 2 h;and the rates of invasion were(16.1 ±4.3)%，(35.8 ±5.1)%，(50.2 ± 5.7)%，(58.3 ± 6.2)%and(65.9 ± 6.9)%at 4，6，8，10，12 h，respectively.The phenomenon of nuclear condensation and marginalization were shown by DAPI staining and transmission electron microscope in DC 2.4 cells at 6 h of co-cultivation with H37Rv.The characteristic bands of apoptosis by DNA electrophoresis were detected.The activities of caspase-3 and caspase-8 were increased in a time-dependent manner.The rates of DC 2.4 cell apoptosis were(6.4 ± 2.5)%，(11.8 ± 5.3)%and(31.1 ± 8.7)%at 6 h，12 h and 24 h after co-cultivation with H37Rv，respectively.The maximal activities of intracellular caspase-3 and caspase-8 at 10 h and 6 h were(2.01 ±0.09)U/μg and(2.40±0.07)U/μg，respectively，which was significantly different compared with the control groups(P ＜0.05).The activation of caspase-8 was earlier than that of caspase-3.Conclusion:Mycobacterium tuberculosis can induce the apoptosis of DC 2.4 cells，which is associated with the activation of intracellular caspase-3 and caspase-8.

Dendritic cells;Apoptosis;Mycobacterium tuberculosis;Caspases

R 394.2

A

1008-9292(2011)05-0515-07

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.05.009

2011-03-16

2011-05-23

浙江省大学生科技创新项目基金资助项目(851909107);嘉兴市科技计划项目(2011AY1048-2).

朱逢佳(1989-)，女，本科生.

徐水凌(1964-)，男，教授，硕士生导师，主要从事细菌分子和细胞致病机制的研究;E-mail:xu.shuiling@mail.zjxu.edu.cn

［责任编辑 黄晓花］