天麻药材高效液相色谱指纹图谱研究

黄小玲，杨春燕，袁慧文

(1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020; 2.广东省深圳市药品检验所，广东 深圳 518029)

天麻药材高效液相色谱指纹图谱研究

黄小玲1，杨春燕1，袁慧文2

(1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020; 2.广东省深圳市药品检验所，广东 深圳 518029)

目的研究天麻药材的高效液相色谱指纹图谱，为其质量控制提供可靠的方法。方法采用高效液相色谱法。色谱柱为Ultimate XBC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇－1%冰醋酸水溶液(梯度洗脱)，柱温为30℃，流速1 mL/min，检测波长270 nm。结果初步建立了天麻药材的高效液相色谱指纹图谱，标定出16个共有峰;天麻素的加样加收率为102.66%，RSD＜2.5%(n=6)。结论高效液相色谱指纹图谱为天麻药材质量控制提供了一种新方法，并为未知天麻样品的鉴别提供一个准确、快捷的工具。

天麻;高效液相色谱法;指纹图谱;质量控制;天麻素

天麻为兰科多年生草本植物天麻Gastrodia elataBlume的干燥块茎，味甘、性微温，具平肝、息风、止痉等功效，是我国名贵中草药之一，在我国分布广泛。2005年版《中国药典(一部)》中主要以天麻素含量来评价天麻药材的质量[1]。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对10批不同地区的天麻药材进行测定，初步建立了高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，标出16个共有指纹峰;并以天麻素为对照品，测定比较了不同来源的天麻药材中天麻素含量，初步评价药材质量。现报道如下。

1 仪器与试药

Waters 1525型二元高效液相色谱仪，包括Waters 2996型二级管阵列检测器、Empower 2色谱分析软件(美国Waters公司)。甲醇(江苏汉邦科技有限公司，色谱纯);甲醇、乙醇、醋酸(汕头化学试剂厂，分析纯)，其他试剂均为分析纯;水为双蒸水。天麻素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用)，10批天麻样品来源于全国不同产地，由深圳市药品检验所鉴定为兰科药用植物天麻。天麻样品来源TM1为西藏林芝，TM2为高黎贡山(野生)，TM3为云南小草坝，TM4为云南九华公司，TM5为丽江巨甸，TM6为安徽亳州，TM7为安徽大别山，TM8为四川(野生)，TM9为四川(家种)，TM10为陕西略阳九中金，TM对照为中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 天麻素含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Ultimate XB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)和1%冰醋酸水溶液(B)，二元梯度洗脱50 min，0～25 min时，5% ～40%A(V/V)，25～35 min，40% ～80%A(V/V)，35～50 min时80% ～85%A(V/V);流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:270 nm;进样量:20 μL。

2.1.2 溶液配制

取天麻素标准品(干燥至恒重)，用30%甲醇配成0.255 g/L的对照品溶液。取天麻药材，粉碎，取60目筛细粉，精密称取0.500 g，加入15 mL 30%甲醇，超声提取30 min，过0.45 μm滤膜，取滤液，加入1%的壳聚糖溶液(以1%冰醋酸为溶剂)，配成15 mL，4℃冰箱过夜，取上清液，即得供试品溶液。

2.1.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，记录50 min的色谱图。

2.1.4 方法学考察

线性关系考察:精密量取对照品溶液，用水稀配成0.255～25.500 μg/mL 的系列对照品溶液，分别进样 20 μL，测定峰面积积分值。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程Y=15 466.11X－2 459.62，r=0.998 8。结果表明天麻素质量浓度在0.255～25.5 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取1号供试品溶液，进样5次，以15号峰为参照峰，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果单峰面积占总峰面积10%以上指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于 3.0%和 2.5%(n=5)。

稳定性试验:取1号供试品溶液(保存于低温冰箱中)，于配制后 0，2，4，8，12，24，48，72 h 时分别进样，以 15 号峰为参照峰，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果单峰面积占总峰面积10%以上指纹峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于1.53%和1.48%(n=8)，表明供试品溶液在72 h内稳定。

重复性试验:取1号供试品5份，依供试品溶液制备溶液，分别进样，以15号峰为参照峰计算。结果单峰面积占总峰面积10%以上指纹峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.86%和 3.00%(n=5)。

加样回收试验:准确称取1号供试品0.5 g，平行6份，于每份样品准确加入已知质量浓度的天麻素对照品溶液1.5 mL，加入15 mL

30%甲醇，按供试品溶液制备方法处理，计算加样回收率。结果平均加样加收率为102.66%，RSD小于2.5%(n=6)。

2.2 对照指纹图谱的建立

分别将各批样品和天麻对照药材上样分析，记录各自色谱，见图1。根据10批天麻样品和天麻对照药材保留时间的一致性，确定16个共有峰，共中5号峰为天麻素。但由于天麻素对照品成分峰过早出现，故另选出峰时间稳定、峰面积较大且分离度良好的15号峰为参照峰(S)，以其保留时间和峰面积为1，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。以天麻素为对照品，对照药材作为“指纹对照品”[2]，建立天麻药材的HPLC指纹图谱(图1)。可见，10批不同天麻样品都能检出16个指纹峰，但相对峰面积有所不同，表明不同产地天麻化学成分种类相似，但各成分的相对含量与绝对含量略有不同。

图1 天麻药材的高效液相色谱指纹图谱

2.3 共有指纹峰分析

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》[3]和常用中药材HPLC指纹图谱测定技术[4]，单峰峰面积占指纹图谱色谱总面积10%以上的共有指纹峰尚需标定其与参照峰峰面积比值。10批天麻样品16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积(计算平均值)见表 2。可见，其中峰 1、峰 3、峰 5、峰 6、峰 8、峰 9、峰 11、峰 12 共 8 个指纹峰的峰面积均超过峰15(参照峰)的10%以上，可作为天麻定性鉴别、定量检测的依据。相似度是评价有效成分间相对含量一致性的重要指标。以相关系数为主、夹角余弦为辅进行相似度分析，以16个共有指纹峰的相对峰面积为基本参数，对10批天麻样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价。结果见表3。可见，TM2，TM5，TM7，TM10与TM对照的相关系数均在0.9以上，其相应夹角余弦系数也均在0.8以上，说明高黎贡山(野生)、丽江巨甸、安徽大别山和陕西略阳九中金的天麻中各成分的相对含量与对照药材较接近;而TM8(四川野生)的相关系数低于0.6，夹角余弦系数则低于0.4，其他样品的相关系数及夹角余弦系数则界于中间数值，差别较大，可能与样品产地、生长年限、采收时间等因素有关;四川野生天麻的相似度不如四川家种天麻。以上说明，选用的天麻对照药材与四川野生天麻的种属差异较远，而安徽大别山和陕西略阴九中金(家种)产天麻则与天麻对照药材种属亲近。

2.4 主要成分定量分析

对10批样品中天麻素含量依本法进行定量分析，结果见表3。可见，安徽大别山产天麻中的天麻素含量最高，其次是四川家种天麻，高黎贡山(野生)、丽江巨甸、安徽亳州及陕西略阳九中金产天麻中的天麻素含量都超过对照药材，且西藏林芝、云南小草坝和云南九华公司产天麻中的天麻素含量均高于中国药典规定的0.20%，只有四川野生天麻中天麻素的含量低于0.20%。以上结果表明，现代指纹(fingerprint)分析是分析、比较、评价和校验[5]中药材的一种手段。这里的指纹图谱是指狭义的表达植物药代谢产物化学特征，即中药化学(成分)的指纹图谱[6]。

表2 10批样品16个共有峰的相对保留时间及峰面积(平均值)

表3 10批样品共有指纹峰相对峰面积指纹图谱的相似度分析及含量测定结果

3 讨论

本试验初步建立了国内不同产地的天麻药材HPLC指纹图谱，对10批药材进行了相似度评价;初步建立了天麻中天麻素类成分的共有模式，确定了16个共有峰为特征峰。该方法可操作性强、重复性好、图谱相对稳定，可供天麻药材内在质量评价和质量控制标准制订时参考[7]。

采用两相梯度洗脱装置，分别将水相(纯水1%醋酸、0.1%磷酸)和有机相(甲醇、乙腈)按不同配比进行试验，结果以甲醇－1%醋酸水溶液作为流动相时分离效果最佳。取天麻素对照品溶液，以二极管阵列检测器进行全波长检测，结果在226 nm及270 nm波长处均有吸收。但以甲醇－1%醋酸水溶液为流动相时，以226 nm为检测波长时天麻素的吸收峰飘移不定，故选择270 nm为检测波长。还对提取溶剂(甲醇、乙醇及不同比例的乙醇和水)、提取方法(超声、回流)、提取时间等进行了考察，确定了2.1.2项下供试品溶液的提取制备方法。

现阶段，中药的有效成分大多尚未明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好符合中药质量控制的整体性要求，较单一成分或指标成分的质量控制方法更科学、合理[8]。但在中药指纹图谱中，可能还含有很多未知化合物的信息，该对它们作如何处理，仍是一个尚待研究的问题。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:39.

[2]宋 敏，杭太俊，张正行.丹参水溶性成分HPLC指纹图谱对照品对照法的研究[J].中草药，2005，36(3):360 －364.

[3]国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)[J].中成药，2000，22(10):671.

[4]蔡宝昌，刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术[M].北京:化学工业出版社，2005:22－25.

[5]胡芳弟，封士兰，苟子强.中药质量控制方法研究进展[J].兰州医学院学报，2004，30(3):90 －92.

[6]罗国安，王义明.中药指纹图谱的分类和发展[J].中国新药杂志，2002，11(1):46 － 51.

[7]张 艳，范俊安，夏永鹏，等.重庆垫江牡丹皮HPLC指纹图谱研究(Ⅲ)——刮丹皮指纹图谱[J].中国药房，2010，21(3):238－241.

[8]彭苗苗，方 芸.中药复方药效物质基础研究进展[J].中国药房，2010，21(7):659 － 661.

HPLC Fingerprint of Gastrodia elata Blume

Huang Xiaoling1，Yang Chunyan1，Yuan Huiwen2

(1.Shenzhen Chronic Disease Prevention and Cure Centre，Shenzhen，Guangdong，China518020;2
.Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，Guangdong，China518029)

ObjectiveTo study the HPLC fingerprint of medicinal materialGastrodia elataBlume to provide the reliable method for its quality control.Methods The analysis was performed on Ultimate XB － C18column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)with the mobile phase of methanal－1%glacial acetic acid aqueous solution in the gradient elution.The column temperature was 30 ℃ and the flow rate was 1.0 mL/min.The UV detector was set at 270 nm.Results The HPLC fingerprint ofGastrodia elataBlume was preliminarily established and 16 common peaks were displayed in the fingerprint.The average sample recovery rate of gastrodine was 102.66% ，RSD＜ 2.5%(n=6).Conclusion The HPLC fingerprint may provide a new model for controlling the quality of medicinal materialGastrodia elataBlume and also may provide an accurate and rapid tool for identifying unknown sample ofGastrodia elataBlume.

Gastrodia elataBlume;HPLC;fingerprint;quality control;gastrodine

R284.1;R282.71

A

1006－4931(2011)02－0017－03

2010－09－09)