反相高效液相色谱法同时测定茶碱和3种抗癫痫药血药浓度

谢军平，冯玲玲，杨瑞玲

(1.河南省开封市第一人民医院临床药学科，河南 开封 475000; 2.河南大学附属东京医院药剂科，河南 开封 475000)

反相高效液相色谱法同时测定茶碱和3种抗癫痫药血药浓度

谢军平1，冯玲玲1，杨瑞玲2

(1.河南省开封市第一人民医院临床药学科，河南 开封 475000; 2.河南大学附属东京医院药剂科，河南 开封 475000)

目的建立可同时测定茶碱和苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平血药浓度的反相高效液相色谱法。方法色谱柱为Promosil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇－水(60∶40)，检测波长205 nm，流速0.7 mL/min，柱温25℃。结果该色谱条件下，茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平分离良好，血药浓度线性范围茶碱为 0.30 ～ 180.00 μg/mL(r=0.999 7)，苯巴比妥为 0.42 ～169.60 μg/mL(r=0.999 9)，苯妥英钠为 0.40 ～ 170.00 μg/mL(r=0.999 2)，卡马西平为 0.20 ～140.00 μg/mL(r=0999 8)，平均回收率分别是 97.3% ，98.0% ，103.1%，99.3%，日内及日间精密度RSD均小于6%。结论该方法操作简便、快速、准确，4种药物互不干扰，可用于临床血药浓度监测。

反相高效液相色谱法;茶碱;抗癫痫药;血药浓度

茶碱临床上主要用于治疗哮喘和哮喘型慢性支气管炎，但其治疗窗窄(10～20 μg/mL)，易引起头晕、心悸、心律失常、血压剧降、惊厥等茶碱中毒症状。抗癫痫药苯巴比妥对肝药酶有诱导作用，会影响其他药物的正常代谢;苯妥英钠个体差异大，是典型非线性动力学代谢的药物;卡马西平由于自身诱导代谢，会使血药浓度发生较大的变化。临床上治疗癫痫时多主张单一用药，但对于难治性癫痫多采用多药联用的治疗方案，不可避免地会导致抗癫痫药之间的相互作用，且大多数抗癫痫药的治疗窗窄、个体间及个体内的药代动力学特征差异显著[1]，使得血药浓度变化较大。为最大限度地提高药物疗效，降低药品不良反应，以达到合理的个体化用药，监测血药浓度显得尤为重要。笔者建立了可同时测定茶碱和3种抗癫痫药血液浓度的反相高效液相色谱法，样品处理过程简单，测定快速、准确、专属性好，报道如下。

1 仪器与试药

LC－20AT型高效液相色谱仪，包括二元梯度泵、SPD－20A型紫外检测器、LC solution工作站(日本岛津);高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司);WXH微型旋涡混合器(上海跃进医疗器械厂)。茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平对照品(中国药品生物制品检定所);甲醇为色谱纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Promosil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －水(60 ∶40);流速:0.7 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:205 nm;进样量:10 μL。在此条件下，空白血清及空白血清加对照品的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 标准溶液配制

分别准确称取经105℃干燥至恒重的茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平对照品，置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得茶碱标准贮备液(150 μg/mL)、苯巴比妥标准贮备液(212 μg/mL)、苯妥英钠标准贮备液(200 μg/mL)、卡马西平标准贮备液(100 μg/mL)，于4℃冰箱贮存。

2.3 血清样品处理

精密量取血清0.2 mL，置1.5 mL尖底塑料离心管中，加入甲醇0.5 mL，涡旋3 min，以12 000 r/min转速离心5 min，取上清液，经 0.45 μm 过滤器过滤，取 10 μL 进样。

2.4 标准曲线绘制

因测定的范围较广，故精密吸取各药物的标准贮备液1 mL，置50 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，制成稀释混合工作液，精密吸取上述稀释混合工作液20，50，100 μL;分别精密吸取茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平标准贮备液适量，加入空白血清，使成不同质量浓度梯度(茶碱为 0.30，0.75，1.50，7.50，22.50，75.00，135.00，180.00 μg/mL; 苯 巴 比 妥 为 0.42，1.05，2.10，5.30，21.20，84.80，127.20，169.60 μg/mL;苯 妥英 钠 为 0.40，1.00，2.00，5.00，20.00，80.00，120.00，170.00 μg/mL;卡马 西平为0.20，0.50，1.00，5.00，25.00，60.00，100.00，140.00 μg/mL)的血清样品，按2.3项下血清样品处理方法处理。用外标法峰面积定量，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，结果茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的出峰时间分别为2.8，4.5，6.7，7.5 min。回归方程、线性范围及检测限见表 1。

2.5 回收率及试验

将每种药物均配制成低、中、高3种质量浓度的含药血清各5份，按2.3项下血清样品处理方法处理后进样分析，将测得的峰面积代入回归方程计算测得量，测得量与加入量之比即为相对回收率;另用水准确配制高、中、低3种质量浓度的含药血清样品各5份，同法处理，以血清峰面积与未经提取的相同量标准品峰面积之比，计算其绝对回收率。结果见表2。

表1 茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的标准曲线

2.6 精密度试验

分别在同日内测定5次和连续5 d每天测定1次血药浓度，计算日内精密度、日间精密度。结果见表2。

表2 茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的回收率及精密度试验结果(n=5)

2.7 干扰试验

从临床合并用药情况看，地西泮、硝西泮、扑米酮、丙戊酸等多种药物均不干扰茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的测定。

3 讨论

本方法中采用的柱温、流速均较文献[2－4]报道的低，相对可延长色谱柱的使用寿命。参考相关文献，分别选择不同的检测波长(205，210，220，230，240，254，280 nm)及不同比例的甲醇 － 水流动相(50 ∶50，55 ∶45，60 ∶40)进行试验，结果选择检测波长为 205 nm、流动相为甲醇－水(60∶40)。在此色谱条件下，茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠的检测色谱信号响应大大提高，卡马西平的检测色谱信号响应比210 nm波长处稍低但比其他波长处均高，无需在流动相中加入改性剂如正丁胺、乙二胺或冰醋酸等，4种药物分离良好。本方法避免了文献中样品预处理时使用乙醚或改变酸碱度、试剂贵、挥发性大、易燃、不太稳定、放置后易产生过氧化物、用前需作烦琐的预处理、操作费时的缺陷。所用的流动相为甲醇－水，呈中性，对色谱柱及仪器的损害小，沉淀剂为甲醇一次沉淀，高速(12 000 r/min)离心后直接进样，减少了提取液吹干、流动相复溶的步骤，避免了分离体积不易控制、操作时间长的缺点。笔者建立的反相高效液相色谱法具有灵敏度高、专一性强等优点，其测定的线性范围较文献报道的广，且茶碱测定的线性范围尚未见报道。此方法样品预处理简单，只需甲醇一次沉淀蛋白即可，约8 min可测定1个样品，精密度好，回收率高，不需要改变实验方法和色谱条件即可同时测定4种药物，提高了工作效率，扩展了适应性，适用于临床治疗药物血药浓度的监测。

[1]焦 正，钟康明，施孝金，等.抗癫痫药物监测[J].中国临床药学杂志，2004，13(6):386 －389.

[2]陈 玲，罗文鸿，李 慧，等.高效液相色谱法同时测定血清中苯妥英、卡马西平的浓度[J].中国医院药学杂志，2000，20(11):645－647.

[3]李碧峰，冯惠平，贾晋蓉，等.RP－HPLC法测定人血浆中苯巴比妥的浓度[J].中国药房，2008，19(26):2 024 －2 026.

[4]蔡 洪.HPLC法同时测定三种抗癫痫药物的血清浓度[J].湖南医学高等专科学校学报，2000，2(4):32－34.

Simultaneous Determination of Serum Concentrations of Theophylline and Three Antiepileptic Drugs by RP－HPLC

Xie Junping1，Feng Lingling1，Yang Ruiling2
(1.Department of Clinical Pharmacy，Kaifeng First People's Hospital，Kaifeng，Henan，China475000;
2.Department of Pharmacy，Affiliated Dongjing Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan，China475000)

ObjectiveTo establish a method for determining the serum concentrations of theophylline， Phenobarbital， phenytoin sodium and carbamazepine by RP － HPLC.Methods The analytical column was Promasil C18column(150 mm × 4.6 mm，5 μm).The mobile phase consisted of methanol－ water(60 ∶40)at the flow rate of 0.7 mL/min.The detection wavelength was set at 205 nm and the column temperature was set at 25 ℃.Results Theophylline，phenobarbital，phenytoin sodium and carbamazepine were separated well under the chromatographic condition.The linear ranges were 0.30 － 180.00 μg/mL(r=0.999 7)for theophylline，0.42 － 169.60 μg/mL(r=0.999 9)for phenobarbital，0.40 － 170.00 μg/mL(r=0.999 2)for phenytoin sodium and 0.20 － 140.00 μg/mL(r=0.999 8)for carbamazepine respectively.The mean relative recovery rates of theophylline，Phenobarbital，phenytoin sodium and carbamazapine were 97.3% ，98.0% ，103.1% and 99.3% respectively.The intra － day and the inter－ dayRSDall was less than 6%.Conclusion This method is simple，rapid，accurate without interfering with each other，which is suitable for the blood concentration monitoring of therapeutic drugs.

RP－HPLC;theophylline;antiepileptic drug;serum drug concentration

R969.1;R927.2

A

1006－4931(2011)02－0022－03

谢军平，女，本科，副主任药师，(电话)0378－5672547(电子信箱)xjp630@163.com。

2010－01－04;

2010－04－28)