桑叶功能活性物质提取工艺研究进展

李 勇 胡兴明 邓 文 叶楚华

(湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉 430070)

桑叶功能活性物质提取工艺研究进展

李 勇 胡兴明 邓 文 叶楚华

(湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉 430070)

对近年来有关桑叶中多糖类、黄酮类及生物碱类活性物质的提取工艺研究进行了综述,为桑叶资源进一步的研究和开发提供依据。

桑叶;活性物质;多糖;黄酮;生物碱;提取工艺

中国是桑树的故乡也是世界上主要的桑叶产地之一。桑叶为桑属植物桑树(Morus alba L.)的叶子,随着科技的不断进步,人们对桑叶的化学成分、生理功能进行了深入研究,发现桑叶中含有丰富的多糖类、黄酮类和生物碱类等多种功能活性成分,具有降血糖、降血压、降血脂及抗病毒等诸多功效［1］。桑叶因其极高的营养、药用价值,已成为食品、医药界关注的热点。为此,我们对近年来有关桑叶中多糖类、黄酮类及生物碱类等主要功能活性物质的提取工艺研究进展进行综述,以期为合理开发利用桑叶资源提供依据。

1 桑叶多糖类活性物质提取工艺研究

多糖是所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构材料,参与生物细胞的各种活动,具有多方面的生物活性和功能。现代医学证明,桑叶总多糖对四氧嘧啶造成的大鼠糖尿病有显著的降血糖作用,而且多糖作为药物对人和动物没有毒副作用［2］,因而对于桑叶多糖的研究已引起人们的极大兴趣。多糖的提取方法很多,一般桑叶多糖多采用水浸提,或辅以微波法、超声波法、酶法或超高压法等处理方法来提取分离。

1.1 水浸提法

桑叶多糖的水浸提法工艺一般是桑叶经超微粉碎后,于适量蒸馏水中保持恒温提取一定时间,经离心、浓缩、Sevag法或其它方法脱蛋白、无水乙醇沉淀和干燥处理等工艺得桑叶粗多糖。刘咏［3］利用水煮醇沉法从桑叶中提取可溶性多糖,通过 Sevag法除蛋白,粗多糖过葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)柱层析进行纯化分离,用苯酚—硫酸法测定多糖含量,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检查,通过正交试验确定了提取桑叶多糖的优化条件为水浴温度100 ℃、桑叶 ∶水量 =1∶100(w/v)、浸提 60 min、pH值 4为最佳提取条件,其多糖含量达 98.52 mg/g(DW)。刘树兴等［4］利用水浸提法,通过三氯乙酸法除去多糖中的蛋白质,用苯酚—硫酸法测定多糖的含量,利用正交试验确定出桑叶多糖提取的最优化条件为水浴温度 100℃、pH值 1l、料液比(桑叶∶水)=1∶50(w/v)、浸提 2 h,提取率达 90.5%。张琳华等［5］采用 L9(34)正交试验,对影响多糖的水提取工艺和醇沉分离工艺的因素水平进行了研究,比较了稀酸、稀碱、蒸馏水 3种提取方法和不同蛋白去除法对多糖提取分离的影响,结果表明:桑叶多糖的最佳提取工艺为用 10倍的蒸馏水在 70℃下提取 2次,每次 1.5 h;醇沉分离最佳工艺是醇沉时乙醇体积分数 80%,药液浓缩至 1m L/g,pH值 4。用三氯乙酸(TCA)法去除蛋白质的效果优于传统的 Savage法。应芝等［6］利用响应面分析法(RSM)优化桑叶多糖的提取工艺。采用单因素试验选取试验因素与水平。根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理,采用 4因素 3水平的响应面分析法;在分析各因素显著性及其交互作用的基础上,得出桑叶多糖的最佳提取工艺条件:提取温度 77℃,料液比1∶17,提取时间 85min,提取 2次,实际测得的桑叶多糖得率为 4.67%,与模型预测值基本相符。

1.2 微波辅助法

随着微波化学新技术的发展,新的微波破壁提取分离技术已经应用于各种天然有机物的提取工艺研究。因为超高频率的微波快速加热,使植物细胞部分破裂,多糖等胞内成分易扩散至细胞外溶剂中,从而明显提高浸出率。

邢东旭等［7］以干燥桑叶粉为材料,在单因素实验的基础上,采用 Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法,研究了提取时间、微波功率和料液比对桑叶多糖提取率的影响,确定了微波提取桑叶多糖的最佳工艺条件:微波时间 10 min,微波功率320W,料液比 1∶45,在此最优工艺下桑叶多糖提取率的理论值为 5.45%;与热水浸提法相比,微波法提取率高,且所得桑叶多糖更能明显提高四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量,是一种更好的桑叶多糖提取方法。王尉等［8］利用微波辅助技术进行桑叶多糖提取,通过单因素实验确定因素与水平,应用 Box-Behnken设计 3因素 3水平的试验,依据回归分析确定了最优的提取工艺条件,结果表明微波辅助提取桑叶多糖的优化提取工艺条件:温度 88℃、时间11min和液固比 18∶1,提取的多糖含量为15.20mg/g,微波辅助提取的多糖含量分别比传统水提法提取10min和 60min时,高 2.18倍和 0.23倍。

1.3 超声波辅助法

超声波是一种弹性机械振动波,它可以产生强烈振动、高速度、强烈的空化效应以及搅拌作用,能够破坏植物细胞的细胞膜,从而加速有效成分的释放与溶出。与传统的溶剂提取法相比,该法提取率高,提取速度快,作为植物功能活性成分提取新工艺,有很好的应用前景。

刘学军等［9］研究了超声波提取桑叶多糖工艺中超声波功率、温度、时间和粒径对桑叶多糖提取率的影响,并利用正交实验对上述 4个工艺参数进行了优化,结果表明:超声波提取桑叶多糖的最佳工艺条件为超声波功率 50W,提取温度为 85℃,提取时间 2.5 h,原料粒径 80目;在此条件下进行 2次重复实验得出平均提取率为 10.74,重复性较好。王丰俊等［10］针对桑叶多糖的超声波辅助提取,首先通过单因素试验选取影响因素与水平,然后在单因素试验的基础上采用 4因素 3水平的响应面分析法,依据回归分析确定了较优提取工艺条件,结果表明其较优工艺条件:提取温度 81.5℃,超声波时间30 min,超声波功率 100W,水料比 10∶1;采用该工艺条件,桑叶多糖的提取得率达到 2.99%。杨青珍等［11］通过单因素和正交试验设计,探讨了龙桑叶多糖的超声辅助提取工艺条件,试验结果表明,龙桑叶多糖的最适提取工艺条件:料液比 1∶40,温度70℃,水浴时间 2 h,超声波处理时间 20min;采用该工艺条件,龙桑叶多糖的提取得率超过 1.00%。

1.4 酶辅助法

植物细胞内存在着一定量的蛋白质、纤维素、半纤维素、果胶质等成分,这些物质是胞内多糖等大分子溶出的主要屏障,它们的分解有利于糖类物质的溶出。桑叶多糖酶辅助法提取就是基于此考虑,通过添加胰蛋白酶、纤维素酶或果胶酶等对样品进行前处理来提高桑叶多糖的得率。

夏平等［12］研究了复合酶法(纤维素酶∶果胶酶 =1∶1)提取桑叶中多糖。通过单因素和正交试验研究了酶的浓度、酶作用的时间、酶作用的温度以及酶作用的 pH值对桑叶粗多糖提取率的影响,结果表明:酶辅助法提取的最佳工艺条件为温度 50℃、pH值 4.5、酶用量 1.0%、提取时间 1 h;提取桑叶多糖的得率可达 14.32%。王芳等［13］研究了超声波法、酶法和微波法等不同的前处理方法对桑叶多糖提取效率的影响,结果表明:提取桑叶多糖的得率依次为酶辅助法 ＞超声辅助法 ＞微波辅助法,其中纤维素酶为桑叶多糖的最佳酶提取剂,其酶解的较优方案是酶用量为桑叶量的 1.5%,酶解时间 2 h,酶解温度50℃,酶处理后水提多糖得率可达 12.49%。

1.5 超高压辅助法

超高压提取(UHPE)技术是一种全新的天然产物有效成分提取技术,它是在常温条件下,利用100 MPa以上的流体静压力作用于料液上,保压一段时间(5 min左右),然后迅速卸压,进行萃取,达到提取的目的。该技术具有操作简单、提取率高、时间短、杂质含量少、能耗低以及环保等优点,在功能食品、药品的加工和开发应用中具有较大的潜力和价值。

凌庆枝等［14］在单因素试验的基础上,采用正交试验法对桑叶多糖的超高压提取工艺进行了优选。利用L9(34)进行正交试验,以桑叶多糖的得率为指标,考察了超高压压力、保压时间、pH值和固液比(W∶V)对桑叶多糖得率的影响,结果表明:桑叶多糖的最佳提取工艺条件为超高压压力 300 MPa、超高压处理时间 4.5min、pH值 9.0、固液比 1∶16时,桑叶多糖的提取得率可达 2.23%。同热浸提取和超声提取方法相比,超高压提取方法得率高、提取时间短,是提取桑叶多糖的适宜方法。

2 桑叶黄酮类活性物质提取工艺研究

黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位,尤其是叶部含量较高,是一种天然抗氧化剂。具有清除人体中超氧离子自由基、抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂和镇痛等生物活性和生理活性作用。桑叶黄酮类物质的提取方法很多,一般多采用柱层析—醇浸提法,或辅以微波法、超声波法或超高压法等处理方法来提取分离。

2.1 柱层析—醇浸提法

桑叶黄酮类活性物质的醇浸提法是将桑叶干粉煮沸、过滤,经大孔树脂吸附,水洗至无色后,用50%～80%质量浓度乙醇或甲醇洗脱,洗脱液低温浓缩干燥后得桑叶粗黄酮,利用无水乙醇溶解,再经过滤、浓缩、干燥处理等工艺得精制桑叶黄酮类物质。

杨虎等［15］研究了利用乙醇提取桑叶中的黄酮类物质,采用正交实验考察了回流提取时间、提取次数、乙醇浓度、料液比等因素对提取率的影响,确定了最佳工艺条件:回流提取时间 1.5 h,提取 3次,乙醇浓度 80%,料液比(质量比)1∶30,提取率可达0.723%。张军等［16］研究了不同单因子对桑叶中黄酮成分浸提效果的影响,试验结果表明:用 80%乙醇作溶剂,原料质量浓度为 50.00 g/L,于 70℃、pH值 8的条件下浸提 3 h并抽提 2次的提取效果较好,提取得率超过 2.5%。陈月红等［17］利用 L9(34)正交表优选提取条件,通过考察上柱方法、提取方法、粉碎度对桑叶总黄酮得率的影响,探讨了桑叶总黄酮的最佳提取工艺,结果表明:80目细桑叶干粉,于 16倍原料的 80%乙醇中,经大孔树脂柱层析回流提取 2次,每次 1 h时桑叶粗黄酮得率最佳达11%,且稳定性良好、简便易行。

2.2 微波辅助法

李莉［18］研究了以水或 70%乙醇溶剂,微波处理或非微波处理桑叶的各种方法对提取桑叶总黄酮得率的影响,结果表明:桑叶样品经微波处理10 min,以 70%乙醇作溶剂提取桑叶总黄酮的浸出率最高,达 69.01%。陈菁菁等［19］采用正交试验设计优选出了微波萃取桑叶黄酮的最佳工艺条件,当桑叶样品于 12倍量 70%乙醇,60℃微波萃取20 min时,桑叶黄酮得率最高,且应用微波萃取法比传统醇提法桑叶黄酮得率高 55%。胡庆国［20］研究了用微波法提取桑叶中黄酮的工艺条件,探讨了微波强度、处理时间、乙醇体积分数、提取温度和提取时间对桑叶黄酮提取率的影响,结果表明:用 175W微波强度处理 4 min后,以体积分数70%的乙醇,在70℃提取 2 h,得到提取物的黄酮类物质质量浓度比未经微波处理的高出 18.5%。

2.3 超声波辅助法

高中松等［21］采用醇浸提法、超声提取法探讨了从桑叶中提取总黄酮类物质的最佳工艺,结果表明:通过单因素试验和正交试验,超声提取效果最好,其最佳条件是用浓度为 70%的乙醇,按料液比1∶15的比例浸泡 3 h,再用超声提取 45m in,其桑叶中总黄酮类物质的提取率可达 2.18%。王丽娟等［22］在优化选择桑叶总黄酮的最佳超声提取工艺研究中,采用正交实验法,以提取液中总黄酮含量为考察指标,确定了桑叶总黄酮的最佳超声提取工艺为用 20倍量 50%乙醇,超声提取 30min;采用该工艺条件,提取液中总黄酮含量达 2.38%。李宇亮等［23］研究了基于微波破壁处理的超声提取桑叶中黄酮的工艺,当取料液比为 1∶8,微波破壁 3次,每次 30 s,pH值5.5时,超声提取 30min(功率 1 800W),黄酮的提取率达到 96.9%,得率为 8.74 mg/g,纯度达 95.13%;且该工艺中,微波破壁结合超声提取与传统的煎煮法相比较,具有成本低、产物收率高、并可显著降低提取液中杂质含量等优点。

2.4 超高压辅助法

励建荣等［24］研究了常温下超高压提取桑叶黄酮类化合物芦丁的提取工艺,观察了不同提取溶剂、提取压力、溶剂与原料比、提取时间及桑叶颗粒大小等因素对桑叶芦丁提取率的影响,并对提取工艺进行了优化,结果表明:当以 70%乙醇水溶液为提取溶剂,提取压力为 500MPa,提取时间为 8 min,桑叶颗粒大小为 0.18～0.25 nm,溶剂与原料比为 20∶1时,桑叶黄酮类化合物芦丁的提取率可达 23.9mg/g。

3 桑叶生物碱类活性物质提取工艺研究

生物碱也是桑叶的主要活性成分之一。日本学者 Asano等［25］从桑叶中分离出多种多羟基生物碱,其中 DNJ(1-脱氧野尻霉素)在桑叶中含量达0.1l%,且其作为 α-葡萄糖苷酶的抑制剂,具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移等作用;另外,DNJ还是 α-葡萄糖淀粉酶的有效抑制剂,DNJ作为载体,还可用于高纯度麦芽糖酶的合成,具有较高的医疗价值。目前国内外尤其是日本和韩国对桑叶生物碱类活性物质药理作用的研究较多,但对 DNJ提取工艺的研究相对较少。

李宇亮等［26］研究了从桑叶中提取分离 DNJ,探讨了提取剂、提取方法、料液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响,实验表明:提取的最佳条件是以65%的乙醇为提取剂,按料液比 1∶8超声强化细胞破碎 20 min(功率 1 800 W),732 H阳离子树脂分离,0.25 mol/L的氨水洗脱(洗脱速度 1～2 mL/min),提取率为 95.8%,纯度为 92.3%以上。胡瑞君等［27］利用微波辅助提取技术提取桑叶中生物碱 DNJ,考察了微波功率、微波处理时间、固液比和提取次数等因素对 DNJ得率的影响,确定了最佳提取工艺条件:微波功率为 406W、微波处理时间1.5min、固液比 (g∶m L)为 1∶40、提取次数为 2次 ,提取率超过 80%,提取得率达 0.024%,为以后开发研制降血糖药品和保健食品提供了可能,也为桑叶在这方面的进一步开发利用提供了技术支持。

4 结语

当今科学技术日新月异,先进的提取纯化和检测设备更新换代周期越来越短,促使提取纯化工艺和检测手段更加简单化、经济化。随着提取方法的不断完善,桑叶功能活性成分在食品、医药中的应用范围将越来越广。我国有着丰富的桑叶资源,研究桑叶功能活性成分提取分离技术,开发桑叶新用途,改善传统的桑叶利用结构,对于提高桑叶的利用价值,拓宽蚕桑产业的经济基础,保持蚕桑产业的活力具有重要意义。

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S888.2

B

1007-0982(2011)02-0004-05

2010-12-20;

2011-02-18

现代农业产业技术体系建设专项(蚕桑)。

李勇(1980—),男,山东菏泽,硕士,助理研究员。

Tel:027-87106001,E-mail:liyong8057@163.com

胡兴明(1963—),男,研究员,硕士生导师。

Tel:027-87380366,E-mail:hxm@hbaas.com