TTF-2和TGFβ3在C57BL/6J小鼠腭突发育过程中的表达变化

黄磊 石冰 宋庆高 王龑 郑谦

哺乳动物继发腭的发育是一个复杂过程，涉及到将口鼻腔正确分离的几个过程的协调一致，从腭突产生(胚胎12 d)、上抬(胚胎13 d)到两侧腭突相对运动接触直至融合(胚胎14 d)，最后覆盖在口腔侧和鼻腔侧的黏膜分别分化为复层鳞状上皮和假复层纤毛状上皮，这些过程中任何一个环节发生改变都可引起腭裂。目前发现titf2和重组人转化生长因子β3(TGFβ3)基因突变与这种先天畸形密切相关。Titf2-/-小鼠［1］和人类甲状腺转素因子-2(TTF-2)［2，3］基因纯合缺陷表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形，TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突变也可引起腭裂。在小鼠发育过程中，TTF-2有促进甲状腺前体细胞迁徙，抑制甲状腺前体细胞在迁徙过程中分化功能［4］，但对腭中嵴上皮细胞迁徙是否有影响，尚不清楚。TGFβ3主要在腭中嵴上皮细胞表达，在腭突黏附时起关键作用。本研究旨在观察在继发腭发育过程中，TTF-2和TGFβ3相互作用变化规律。

1 材料与方法

1.1 实验动物 (1)成年C57BL/6J小鼠购自四川大学华西医学中心动物中心，雌鼠4～6周，体重12.0～14.5 g，雄鼠＞6周龄，体重＞20 g，保持12 h昼夜周期制，室温控制在20～25℃，充足食物，自由饮水(pH值为5)。(2)按雌雄比例2∶1于头晚20∶00至次日晨8∶00合笼，并于次日晨检查雌鼠，有阴道栓者为交配阳性，定此日为妊娠零天，记为受孕天数GD0。(3)于妊娠12、13、14 d分别断颈处死各6只鼠，无菌条件取出胚胎，用眼科剪解离腭突。

1.2 主要试剂 TTF-2羊抗小鼠多克隆IgG购自Santa Cruz，Actin(I-1q)羊抗小鼠多克隆IgG购自Santa Cruz，产品编号SC-1616，Protein DetecterTMWestern Blot Kit BCIP/NBTSystem 购自KPL公司(产品号55-11-50)，SABC-AP免疫组化试剂盒购自博士得公司，产品编号:SA105，APES购自中山公司产品编号ZII-9001、组织细胞蛋白裂解液RIPA购自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3 组织蛋白提取 (1)每100毫克腭突组织加入1 ml RIPA和10μl PMSF，在冰水浴中电动匀浆。匀浆后冰水浴放置30 min。(2)将样品转移到1.5 ml离心管，4℃ 20 000 g离心30 min，将上清液转移到无菌离心管中备用。

1.4 Western印记检测TTF-2 取上清液10μl经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸素纤维膜上，1%酪蛋白封闭1 h后，加入1∶500稀释的羊抗鼠TTF-2多克隆抗体IgG于4℃孵育过夜，于4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗膜后，1∶2 000稀释的AP一兔抗羊IgG于37℃孵育30min，PBS洗膜后，BCIP/NBT显色。

1.5 免疫组织化学检测TTF-2和TGFβ (1)切片制备:将12、13、14 d胎鼠，从口角剪开，显露腭突，给胚胎头部矢状平面连续切取6μm厚切片数张，切片贴于经2%APES防脱片剂打底的载玻片上，经丙酮固定后-20℃贮存备用。(2)冰冻切片免疫组织化学染色步骤:滴加正常兔或山羊血清封闭液，室温20 min，滴加抗TTF-2IgG(1∶100 稀释)或抗TGFβ3 IgG(1∶50 稀释)一抗，4℃过夜，滴加生物素化二抗，室温20 min，滴加SABC-AP，室温20 min，BCIP/NBT显色，核固红轻度复染，干燥后水溶性封片剂封片。

2 结果

2.1 C57BL/6J 12、13、14 d胎鼠腭突TTF-2表达Western印记结果。见图1、表1。

图1 TTF-2表达Western印记

表1 TTF-2表达Western blotting灰度扫描测量结果n=6，±s

表1 TTF-2表达Western blotting灰度扫描测量结果n=6，±s

.00 12 d 13 d 14 d 15 d TTF-2/β-actin 6 310±1 506 7 649±2 379 6 279±1 473 0.00±0

2.2 妊娠12、13、14、15 d胎鼠腭突TTF-2表达变化，从折线图可见随着腭突的发育，TTF-2表达变化趋势:TTF-2在胎胚13 d时表达最多，在胚胎14 d时表达明显比13 d时减少，胚胎15 d时已不能检测到TTF-2表达。见图2。

图2 TTF-2变化趋势

2.3 TTF-2、TGFβ3在C57BL/6J 14 d胎鼠腭突冰冻切片免疫组化染色。TTF-2和TGFβ3主要位于腭突中嵴上皮细胞核及核膜上，其免疫组化染色阳性部位在胞核及核膜。在12 d胚胎中，腭突从上颌突伸出呈垂直位，在腭突的上皮细胞中有TTF-2免疫组化染色阳性细胞，在间充质中则为零星分布，此时未见TGFβ3染色阳性细胞。胚胎13 d时，腭突在舌体上方呈水平位，TTF-2在腭突表面上皮细胞中，染色强度较12 d时明显增强，此时在腭突上皮细胞中亦可见TGFβ3染色阳性细胞。14 d时，两侧腭突已接触，腭突表面为单层上皮细胞，可见TTF-2染色阳性细胞，但染色强度明显较12 d时低，此时可见TGFβ3染色最明显。见图3、4。

图3 胚胎14 d TTF-2在腭突表达(免疫组化×200)

图4 胚胎14 d TGFβ3在腭突表达情况(免疫组化×200)

3 讨论

3.1 腭突融合机制 腭突发育过程中，在腭突垂直生长期(12 d)腭中嵴上皮细胞为两层，腭突上抬呈水平方向生长后(13 d)中嵴上皮细胞由两层变一层。这有助于腭突发生接触(14 d)时两侧腭突上皮细胞快速相互插入至间充质细胞而融合。遗传和(或)环境因素干扰，可对人和动物胚胎组织腭突中嵴上皮细胞的转归造成不利的影响。黄磊等［4］研究了地塞米松(DEX)对体外培养的小鼠腭突融合过程的影响，发现DEX促进了腭中嵴上皮分化成复层鳞状上皮，引起腭突融合障碍，提示腭中嵴上皮的正常转归对腭突的融合有决定性作用。

3.2 小鼠腭突发育过程中TTF-2表达的时空性 TTF-2是甲状腺转录因子，为磷酸化蛋白，分子量42 kDa，编码基因Titf2［5］。titf2-/-小鼠［1］和人类 TTF-2［2，3］纯合突变均会引起甲状腺发育缺陷和腭裂。小鼠发育过程中TTF-2表达有时空性及双相性，可抑制甲状腺迁徙过程中特殊上皮细胞--甲状腺滤泡细胞分化成熟［5］。为了更好地理解TTF-2在腭突形成中的作用，我们使用羊抗小鼠TTF-2多克隆抗体IgG，采用免疫组织化学和western blot方法，原位和半定量详尽研究了小鼠胚胎发育的12、13、14 d，TTF-2在小鼠腭突中表达变化情况。在C57BL/6J小鼠胚胎的腭突形成(12 d)，上抬(13 d)和融合(14 d)的发育过程中，TTF-2的表达以13 d为最高，免疫组织化学和Western blot结果一致，均证实了这一点，说明腭突中嵴上皮细胞的分化抑制在13 d时达高峰，随着腭突的发育TTF-2表达减少。TTF-2在12、13、14 d的表达差异有统计学意义(P＜0.05)，胚胎15 d时，已不能检测到 TTF-2表达，这与15 d腭突上皮开始分化相一致，此时口腔腭突上皮分化为复层鳞状上皮，鼻腔分化为假复层纤毛柱状上皮。

3.3 小鼠腭突发育过程中TGFβ3表达的时空性 TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突变均可引起腭裂，TGFβ3在腭突中嵴上皮细胞的黏附过程中起重要作用。我们研究结果显示:在腭突形成时(胚胎12 d，E12 d)腭突中嵴上皮未检测到TGFβ3表达。但当腭突上抬呈水平方向生长时(E13d)，首次在腭中山嵴上皮细胞中发现TGFβ3表达，随着两侧腭突接触、黏附、融合(E14 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中的表达最明显，当腭突融合完成后(E15 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中表达减少。在腭突发育过程中，间充质细胞中未见TGFβ3表达。组织学观察发现，小鼠胚胎13 d时，腭中嵴上皮表层细胞开始出泡，形成丝状伪足，增加了细胞表面积为两侧腭突腭中嵴上皮细胞黏附作准备。小鼠胚胎14 d时，两则腭中嵴上皮细胞相互插入形成细胞间黏附，小鼠胚胎15 d，两侧腭突融合完成。腭突发育的这些形态学改变与TGFβ3表达变化及其功能是相吻合的。

Pelton等［6，7］研究 TGFβ3主要分布在腭突中嵴上皮细胞，在间充质中也有少量分布，而本研究在13、14、15 d胚胎腭突中嵴上皮细胞中发现TGFB3表达与其研究结果相同，而未在间充质细胞中发现，这一点与他们研究略有不同。

3.4 TGFβ3和TTF-2的相互作用对小鼠腭突发育的影响TGFβ3和TTF-2两种细胞因子均与腭突中嵴上皮细胞的分化转归相关。我们观察到在腭中嵴上皮细胞中TGFβ3的出现较TTF-2延迟1 d，二者均在表达后一天出现峰值，TTF-2的表达变化对TGFβ3表达高峰的出现是有影响的。在腭突上抬为水平方向(E13d)，TTF-2表达达高峰，表现为强烈抑制腭中嵴上皮细胞分化，使腭中嵴上皮由2层转为一层，便于两侧腭中嵴上皮细胞相互插入。此时由于TGFβ3的出现，腭中嵴上皮细胞表面出泡，形成丝状伪足，当两侧腭突接触时(E14d)，TTF-2表达急剧下降，解除对TGFβ3表达抑制，使其表达达高峰，有助于此时部分腭中嵴上皮细胞向间充质细胞转化，另一方面促进两侧腭中嵴上皮细胞黏附。

TGFβ3-/-鼠和titf-2-/-鼠均可出现腭裂，笔者推测二者的协调一致，可能是促使腭突正常融合必要条件，而这种平衡一但受干扰(无论外源性或内源性)则有可能引起腭突发育障碍最终导致腭裂。

1 De Felice M，Ovitt C，Biffali E，et al.A mouse model for hereditary thyroid dysgenesis and cleft palate.Nat Genet，1998，19:395-398.

2 Clifton-Bligh RJ，Wentworth JM，Heinz P，et al.Mutation of the gene encoding human TTF-2 associated with thyroid agenesis，cleft palate and choanal atresia.Nat Genet，1998，19:399-401.

3 Castanet M，Park SM，Smith A，et al.A novel loss-of-functionmutation in TTF-2 is associated with congenital hypothyroidism，thyroid agenesis and cleft palate.Hum Mol Genet，2002，11:2051-2059.

4 黄磊，石冰，孙晋虎，等.地塞米松对体外培养A系小鼠腭突腭中嵴上皮融合的影响.华西口腔医学杂志，2005，23:103-105.

5 Zannini M，Avantaggiato V，Biffali E，et al.TTF-2，a new forkhead protein，shows a temporal expression in the developing thyroid which is consistentwith a role in controlling the onset of differentiation.EMBO J，1997，16:3185-3197.

6 Pelton RW，Hogon BLM，Miller DA，etal.Differential expression of genes encoding.TGFs beta1，beta2，and beta3 during murine Palate formation Dev Biol，1990，141:456-460.

7 Lidral AC，Murray JC，Beutow KH，et al.Studies of the Candidates genes TGFB2，MSX1，TGFA，and TGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the Phillipines.Cleft Palate Craniofac J，1997，34:1-6.