不同浓度HAES在正常人体外对IL-10和IL-12的影响

胡万宁 甘建辉 毛瑞英 孙桂苓 宋雨婷 刘秀立 王春立 陈东

随着血浆代用品的应用日益广泛，研究表明，羟乙基淀粉类血浆代用品(HAES)对体内抗肿瘤免疫系统无不良影响［1］，并且术前输注羟乙基淀粉能有地减轻手术和麻醉导致机体免疫系统功能的抑制［2］。但血浆代用品用于非恶性肿瘤患者的研究国内外报道亦少见。本试验试图研究贺斯对健康者血液中免疫系统细胞因子在体外的影响，以检验其是否抑制健康者的免疫系统。为羟乙基淀粉类血浆代用品的临床应用提供更广泛的理论及试验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年3至12月河北省唐山市人民医院健康志愿者30例，其中男18例，女12例;年龄25～40岁。在严格无菌的条件下，分别抽取静脉血20ml入无菌试管，并以肝素抗凝，待用。在超净台内分离出单个核细胞，计数后将细胞平均分成5组:1640培养液阴性对照组、10%血浆对照组、10%贺斯试验组、20%贺斯试验组、40%贺斯试验组，然后再将各组分成阴性对照组、加脂多糖(LPS)、加植物血凝素(PHA)，使单个核细胞在不同的培养液中培养48 h后，1 500 r/min离心5 min后汲取上清液，待检测。

1.2 试验方法 应用晶美生物工程(深圳)试剂盒行双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各上清液中细胞因子IL-10和IL-12和的浓度。双抗体夹心ELISA法(以IL-12为例):抗人IL-12单抗包被于酶标板上，标本/标准品中的IL-12与单抗结合，游离成分被洗去。同时加入辣根过氧化物酶标记的亲合素和生物素化的抗人IL-12抗体，生物素与亲合素特异性结合，抗人IL-12抗体与结合在单抗上的人IL-12结合形成免疫复合物，未结合部分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IL-12，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂呈现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值;IL-12浓度与OD450值呈正比，通过绘制标准曲线可求出标本中IL-12的浓度。以标准品浓度作横坐标，OD450值作纵坐标，应用统计软件SPSS 10.0绘制标准曲线。据曲线函数值计算各标本的浓度值。

1.3统计学分析应用SPSS10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在不刺激淋巴细胞克隆的情况下，HAES各组与对照组的IL-10及IL-12浓度虽稍有参差，但差异无统计学意义(P＞0.05);应用LPS及PHA分别刺激B淋巴细胞、单核巨噬细胞和T淋巴细胞的克隆后，差异有统计学意义(P＞0.05)。组内比较:不刺激淋巴细胞克隆与应用LPS及PHA分别刺激B淋巴细胞、单核巨噬细胞和T淋巴细胞克隆的IL-10及IL-12浓度两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、2。

表1 5组IL-10水平比较n=30，pg/m l，±s

表1 5组IL-10水平比较n=30，pg/m l，±s

注:与阴性对照比较，*P ＜0.05;与LPS比较，#P ＜0.05

组别 阴性对照LPS PHA 1640组 101±46 264±60* 481±90*#10%血浆组 150±46 303±66* 510±101*#10%血代组 139±41 297±60* 499±85*#20%血代组 129±34 278±50* 480±68*#40%血代组 134±40 271±66* 473±80*#

表2 5组IL-12水平比较n=30，pg/m l，±s

表2 5组IL-12水平比较n=30，pg/m l，±s

注:与阴性对照比较，*P ＜0.05;与LPS比较，#P ＜0.05

组别 阴性对照LPS PHA 1640组 93±41 233±81* 435±40*#10%血浆组 115±35 251±43* 457±75*#10%血代组 109±25 252±60* 472±65*#20%血代组 108±17 251±36* 450±45*#40%血代组 104±46 242±97* 439±62*#

3 讨论

目前以羟乙基淀粉纠正大手术的低血容量、血液稀释、改善血液流变学等已广泛应用于临床，成为一种减少异体输血的有效方法［3，4］。除补充容量外，常作为自体输血和血液稀释的一种替代物。相对于它的前两代，贺斯不仅能增加血浆容量、改善心排血量和体内的氧运输，改善创伤或血容量不足患者的器官功能和全身血液动力学状态，而且维持容量效应的时间较长，降解迅速，在体内存留时间短，可避免凝血机制的损害［5-7］。

合成培养基是按人和动物体内细胞所需成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。细胞生活在合成培养基中健康透明，利于延长细胞在体外存活的时间。RPMI 1640是一种常用的培养液，其主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。有丝分裂原(mitogen)来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为促使有丝分裂原受体，结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。LPS为一种有丝分裂原，在B淋巴细胞及单核巨噬细胞表面均有其受体，能选择性的刺激B淋巴细胞和单核巨噬细胞克隆;PHA为另一种有丝分裂原，在T淋巴细胞表面有其受体，能选择中分子性刺激T淋巴细胞克隆。

IL是一组由淋巴细胞、单核吞噬细胞和其他非免疫细胞产生的介导白细胞与其他细胞间相互作用的细胞因子。目前已经确认有23种不同的白介素，其重要作用是调节细胞生长、分化、促进免疫应答和介导炎性反应［8］。IL-10是18.7 kD酸性蛋白，主要由TH2、B细胞、单核细胞和肥大细胞等细胞产生，它可以抑制T细胞分泌IFN-γ和白介素-2(IL-2)，同时也可以抑制T细胞增殖作为炎性递质的单核因子的产生，以及由T细胞亚群产生的细胞因子［9］。IL-12是一种分子量70～75 kD的糖蛋白。IL-12是发动细胞免疫的细胞库。主要由单核吞噬细胞产生，具有促进B细胞合成分泌免疫球蛋白(Ig)及Ig类别转换，促进细胞毒性T细胞(TC)、自然杀伤细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞增殖分化，增强杀伤能力［10］。

本试验结果显示:1640培养液组明显较其他组IL-10、IL-12浓度低，说明虽然1640培养液含有多种氨基酸、碳水化合物、维生素、无机离子及小牛血清，但其较人体内环境仍有一定的差距。试验组与血浆组的浓度值较接近，但比较中发现10%的贺斯组与10%的血浆组的浓度值更近似。

其次，不刺激淋巴细胞克隆与应用LPS及PHA分别刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞的克隆三种条件下，两种细胞因子的浓度值迥然不同，又互有联系:(1)在IL-10，血浆浓度测定范围是(150 ±46)pg/ml，加 LPS后，浓度增至(303 ±66)pg/ml，为前者的2倍，这是由于加LPS后B淋巴细胞和单核-巨噬细胞克隆明显增加，一方面直接增加IL-10的产生，另一方面增加其他细胞因子的释放，并作用于T淋巴细胞，刺激其增殖与分化，间接增加IL-10的产生，导致了IL-10浓度的明显提高;加PHA后，浓度增至(510±101)pg/m l，为前者的4～5倍，这是由于加用PHA后，可明显促进T淋巴细胞的克隆增殖，使T淋巴细胞的数量明显增加，因此导致IL-10产生显著增加。然而，IL-10主要由活化的T淋巴细胞产生，因此导致了加LPS后IL-10的浓度变化不如加PHA的明显。(2)在IL-12，血浆浓度测定范围是(115 ±35)pg/ml，加 LPS 后，浓度增至(251 ±43)pg/m l，为前者的2倍，这是由于加LPS后B淋巴细胞和单核-巨噬细胞克隆明显增加，一方面直接增加IL-12的产生，另一方面增加其他细胞因子的释放，并作用于T淋巴细胞，刺激其增殖与分化，间接增加IL-12的产生，导致了IL-12浓度的明显提高;加PHA后，浓度增至(457±75)pg/ml，为前者的4倍，这是由于加用PHA后，可明显促进T淋巴细胞的克隆增殖，使T淋巴细胞的数量明显增加，因此导致IL-12产生显著增加。然而，IL-12主要由活化的T淋巴细胞产生，因此导致了加LPS后IL-12的浓度变化不如加PHA的明显。

综上所述，不刺激淋巴细胞克隆与应用LPS及PHA分别刺激B淋巴细胞、单核巨噬细胞和T淋巴细胞的克隆三种条件下，HAES各组与对照组中两种细胞因子的浓度无显著性差异，提示三个浓度的贺斯在体外环境中不影响免疫细胞的生存、克隆及细胞因子的产生，即:HAES在体外试验中不抑制正常人体免疫系统机能。因而，HAES应用于手术患者围术期以减少异体输血、保护其免疫状态是安全可行的。

1 高鲁渤，杨丽，李锦城.输血与输羟乙基淀粉对人体T细胞亚群和细胞因子的影响.中华血液学杂志，2003，24:265-267.

2 袁世荧，姚尚龙.羟乙基淀粉溶液对手术患者血浆细胞因子的影响.临床麻醉学杂志，2002，18:408-410.

3 Beyer R，Harmening U，Rittmeyer O，et al.Use ofmodified fluid gelatin and hydroxyethyl starch for colloidal volume replacement in major orthopedic surgery.Br JAnaesth，1997，78:44-50.

4 EgliGA，Zollinger A，Eifert B，et al.Effect of progressive haemodilution with hydroxyethyl starch，gelatin and albumin on blood coagulation.Br J Anaesth，1997，78:684-689.

5 庄心良，曾因明，陈伯銮主编.现代麻醉学.第3版.北京:人民卫生出版社，2004.311.

6 Blaicher AM，Reiter WJ，Blaicher W，et al.The effect of hydroxyethyl starch on platelet aggregation in vitro.Anesth Analg，1998，86:1318.

7 Treib J，Haass A，Piclur G，et al.Bleeding complications can be avoided using hydroxyethyl starch with a low MW in vivo.Intensive Care Medicine，1999，23:60.

8 黄振国，陈婷梅.细胞因子检测的方法及其临床应用.中国检验医学与临床，2003，4:75-77.

9 Livasy CA，Moore D，Cance WG，et al.Focal adhesion kinaseoverexpression in endometrial neoplasia.Appl Immunohistochem Mol morphol，2004，12:342-345.

10 甘建辉，陈杰，李峰，等.依托咪酯和丙泊酚麻醉对乳腺癌根治术患者围术期血浆细胞因子的影响.第四军医大学学报，2008，29:封3-01.