趋化因子在卵巢癌组织中的表达及其意义

郑立红，陈 萍，梅庆步，刘 枫，吴 楠

（齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

趋化因子在卵巢癌组织中的表达及其意义

郑立红，陈 萍，梅庆步，刘 枫，吴 楠

（齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

目的：探讨卵巢癌组织中趋化因子（RANTES）蛋白与mRNA的表达水平及临床意义。方法：采用免疫组化法和原位杂交技术检测卵巢癌组织中RANTES蛋白和mRNA表达，分析其与卵巢癌生物学特征之间的关系。结果：RANTES蛋白在卵巢癌及转移灶中的阳性率明显高于卵巢良性肿瘤，两组差异有统计学意义 （P＜0.05）。RANTES mRNA在卵巢癌及卵巢良性肿瘤中的阳性率分别为75.55%和11.76%，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。RANTES蛋白与mRNA表达与癌的组织学分级及TNM分期有关（P＜0.05）。结论：RANTES蛋白在卵巢癌中有阳性表达，其表达水平与卵巢癌侵袭发展和淋巴结转移有关。

卵巢癌；RANTES；原位杂交；免疫组织化学

卵巢癌（ovarian carcinoma，OC）是女性生殖系统常见恶性肿瘤。在肿瘤微环境内免疫效应细胞的活化及定向迁移过程中，趋化因子发挥着重要的调控功能。趋化因子是一种能够结合到靶细胞上特异性G蛋白偶联受体的化学诱导因子，其参与调节生理性和病理性白细胞迁移。其中受激活调节正常T细胞表达和分泌因子 （regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）是乳腺癌、卵巢癌以及宫颈癌等肿瘤淋巴细胞浸润的主要趋化因子[1-2]。本文采用免疫组化和原位杂交技术对卵巢癌及良性肿瘤组织、卵巢良性疾病组织中RANTES的蛋白和mRNA表达进行研究，以探讨RANTES在卵巢癌中的表达情况及其与临床分期、分化程度及淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集齐齐哈尔医学院附属医院2000～2008年卵巢癌组织及卵巢癌盆腔腹膜转移灶实施根治手术标本45例，上皮性良性肿瘤组17例，卵巢良性疾病组织20例。术前均未接受化疗，患者平均年龄54岁（35～72岁），临床资料完整，石蜡标本保存。

1.2 实验方法

免疫组化检测RANTES蛋白每例标本切取4 μm厚切片，试剂RANTES为鼠单克隆抗体，免疫组化试剂购自福州迈新生物技术公司，具体按常规SP法操作。免疫组化染色性反应应为黄至棕黄色颗粒，RANTES定位细胞浆，以细胞数＞10%为阳性标准，阳性强度分级：细胞数10%～25%为（+），25%～50%为（++），＞50%为（+++）。

原位杂交法检测RANTES mRNA，按原位杂交法的要求对RANTES阳性的病例标本进行固定和石蜡包埋，切片至4～6 μm。石蜡切片经常规脱蜡至水，过氧化物酶和胃蛋白酶处理后，加入预杂交液，40℃湿盒内预杂交3 h，吸除预杂交液，加含有探针杂交液，42℃湿盒内过夜，加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶37℃湿盒内各15 min，DAB显色，中性树胶封片。同时设空白对照组（不含探针）和阴性对照组（预先用RNA酶消化40 min）。阳性杂交结果可见胞浆着色呈棕紫蓝色颗粒。按照阳性细胞比例≤10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分；按染色强弱：阴性为0分；淡黄（蓝）色染色为1分；中度黄（蓝）色染色为2分，棕黄（紫蓝）色染色为3分。

1.3 统计学处理

应用SPSS 10.0统计分析软件处理所有数据，χ2检验比较率的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RANTES蛋白在不同卵巢组织中的表达

卵巢癌组织中RANTES蛋白的阳性表达位于癌细胞的细胞质中，呈弥漫棕黄色颗粒，它们在淋巴结转移组中的表达同非淋巴结转移组中的表达相比，差异均有统计学意义，在正常卵巢组织中多呈阴性表达（表1）。

2.2 RANTES mRNA在不同卵巢组织中的表达

卵巢癌组织中RANTES mRNA的阳性表达位于癌细胞的细胞质中，呈弥漫棕黄色颗粒，在正常卵巢组织中呈阴性表达；它们在淋巴结转移组中的表达同非淋巴结转移组中的表达相比，差异均有统计学意义（表1）。

2.3 卵巢癌中RANTES的表达与临床病理特征的关系

在≥60岁和＜60岁卵巢癌患者中RANTES蛋白和mR NA的表达差异无统计学意义 （P＞0.05）。不同临床分期的RANTES蛋白和mRNA的表达不同，晚期卵巢癌中RANTES蛋白和mRNA阳性表达率明显增高。Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌中RANTES蛋白及mRNA阳性表达与临床病理特征的关系[n（%）]Tab.1 The relationship between RANTES protein and mRNA positive expression and clinical pathological characteristic[n(%)]

3 讨论

已证明很多因素参与肿瘤的侵袭和转移，但不同组织来源的肿瘤细胞迁移到特定部位的分子机制还不清楚。趋化因子是一组结构相关的小分子，具有调节各种类型的白细胞迁移、吸引具有特定趋化因子受体的炎症细胞浸润到炎症部位参与炎症反应的特点。在肿瘤细胞定向迁移的过程中，趋化因子通过与肿瘤细胞表面相应的受体相互作用，能诱导肿瘤细胞骨架重排，促使肿瘤细胞紧密黏附于淋巴管内皮细胞，最终实现定向性迁移[3-4]。RANTES是一种由68个氨基酸组成的小蛋白，属于快速增长CC类趋化因子家族，是趋化T细胞和单个核细胞的CC类趋化性细胞因子，也是一种肿瘤细胞表达的主要趋化性细胞因子，并与卵巢癌、子宫内膜异位症等疾病进展有关[5]。在肿瘤部位，RANTES通过募集并活化单个核细胞和肿瘤细胞导致MMP表达，RANTES促进血管生长可能与增加MMP9表达进而促进肿瘤转移发生有关。RANTES在乳腺癌、宫颈癌中可作为预后的评价指标[6]。卵巢癌患者血清中RANTES的异常升高与肿瘤的分期有关，随着恶性程度的增加，血清RANTES含量增高[7]。Zhou等[8]研究发现，卵巢和子宫内膜基质细胞也同样表达RANTES。本研究通过免疫组化方法，检测到卵巢癌中有RANTES蛋白强阳性表达，其阳性表达率为80%，而在正常卵巢组织中无表达或表达较弱。研究发现，很多趋化因子可能参与了生理性、病理性淋巴管的形成和调节，并参与了肿瘤细胞的移动、归巢和转移的控制[9]。淋巴管的内皮细胞通过分泌趋化因子趋化肿瘤细胞，进而促进肿瘤细胞的淋巴转移[10]。本研究表明，在卵巢癌淋巴结转移灶中RANTES也有强的阳性表达（85.71%），并且RANTES在伴有淋巴结转移病例中的表达显著高于无淋巴结转移者。同时，在分析RANTES表达与临床病理的关系时发现，RANTES的表达与肿瘤病理分级、TNM分期密切相关，而患病年龄无显著差异。进一步通过原位杂交的方法检测卵巢癌中RANTES mRNA的表达情况，结果显示原位杂交与免疫组化结果基本一致，这一结果进一步支持了免疫组化的检测结果。

本研究结果表明，RANTES在卵巢癌组织的高表达与卵巢癌的发展、侵袭和淋巴结转移有关，提示RANTES的表达在卵巢癌侵袭和淋巴结转移中发挥重要作用，RANTES有可能成为卵巢癌治疗的新靶点。

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[7]祁建青,蔡惠萍,杜鸿,等.卵巢癌患者血清中RANTES的浓度水平及其临床意义[J].中国肿瘤临床与康复,2006,13(6):491-493.

[8]Zhou C,Borillo J,Wu J.Ovarian expression of chemokines and their receptors[J].J Reprod Immuno,2004,63(1):1-9.

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Expression and their biological significances of RANTES proteins and mRNA in human ovarian carcinoma

ZHENG Lihong,CHEN Ping,MEI Qingbu,LIU Feng,WU Nan
(Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China)

[Absrtact]Objective:To study the expression of regulated on activation,normal T cell expressed and secreted(RANTES) protein and mRNA in human ovarian carcinoma(OC),evaluate the relationship between the expression of RANTES protein and the clinic pathology factors,and lymph node metastasis of OC and to analyze the clinical significance.Methods:Expression of RANTES was examined by immunohistochemistry in benign ovarian tumors and malignant ovarian carcinoma. The expression of RANTES and mRNA in these specimens were detected by in-situ hybridization.The relationship between expression and biologic characteristic of ovarian carcinoma was analyzed.Results:The positive expression of RANTES protein in ovarian carcinoma was higher than that in benign ovarian tumors,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES protein was closely correlated with the histological grade, lymphatic metastasis and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).The expression rates of RANTES mRNA in ovarian carcinoma and benign ovarian tumors were 75.55%,11.76%respectively,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES mRNA was closely correlated with the histological grade and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).Conclusion:Higher expression of RANTES may be related to development,invasion and metastasis of ovarian carcinoma.

Ovarian carcinoma;RANTES;In-situ hybridization;Immunohistochemistry

R737.31

A

1673-7210（2011）02（c）-024-02

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目名称：卵巢癌腹膜转移趋化因子作用的研究；项目编号：11541414）。

2010-12-16）