黄精对阿尔茨海默病模型大鼠海马组织中Caspase-3表达的影响

马凤巧 (南阳医学高等专科学校基础部生理教研室，河南 南阳 473000)

目前阿尔茨海默病(AD)的防治已成为全球较为热门的研究课题。黄精属传统中药，有补中益气，除风祛湿，安五脏延年等作用，近年来有较多文献报道黄精具有提高记忆力的药理作用〔1，2〕。本实验以D-半乳糖致 AD大鼠模型，研究黄精对 AD大鼠海马组织Caspase-3蛋白表达的影响，探讨黄精提高AD大鼠学习记忆能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康SD清洁大鼠40只(由河南医学动物实验中心提供)，2～3月龄，体重(200±20)g，所有大鼠同室分笼标准条件下饲养。

1.2 方法

1.2.1 分组 在标准环境下适应1 w后，根据实验设计将动物随机分为对照组、模型组、黄精低、高剂量组，每组10只。但实验后各组动物均有缺失。

1.2.2 药品与试剂 黄精购于河南省南阳市医药公司;D-半乳糖购于上海试剂二厂，批号20050422;一抗:Caspase-3兔抗鼠抗体，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.3 给药方法 模型组、黄精低、高剂量组用3%D-半乳糖生理盐水溶液按150 mg·kg-1·d-1颈后部皮下注射，对照组皮下注射等量的生理盐水;同时黄精高、低剂量治疗组分别按10、5 g/kg的黄精水煎剂灌胃，模型组和对照组给予等量的生理盐水灌胃。

1.3 检测方法 6 w后进行Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力和空间探索能力，实验后将大鼠断头处死，在低温冰盘上取出海马组织，通过免疫组化(二步法)检测海马组织中Caspase-3蛋白的表达。采用DMR+Q550型病理图像分析系统进行图像分析，每组次选取8个视野，采用统一的照相倍数采样，对其染色强度进行分析。

1.4 统计学方法 组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 黄精对AD大鼠学习记忆能力的影响 在Morris水迷宫实验中逃避潜伏期(EL)、撤离平台后120 s内穿过原平台象限内游泳距离占整个游泳距离百分比及空间探索次数，模型组与对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)，黄精高剂量组与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)，说明高剂量黄精能提高AD大鼠的学习记忆成绩，明显改善AD大鼠的学习记忆能力。见表1。

2.2 黄精对AD大鼠海马组织内Caspase-3表达的影响Caspase-3多数在胞浆表达，染色定位于胞浆，也可见于胞膜，阳性细胞反应呈黄色到棕褐色，没有Caspase-3表达的细胞为阴性，被染为淡黄色者为弱阳性，被染为棕褐色者为强阳性。免疫组化检测，光镜下苏木素复染后，对照组大鼠海马组织神经细胞核呈淡蓝色，胞浆和突触不着色，未见Caspase-3蛋白表达，呈阴性。模型组大鼠海马神经元中可见大量的棕黄色Caspase-3阳性表达产物，胞浆被染色为棕色，呈强阳性。用黄精煎剂灌胃进行干预后，低剂量治疗组大鼠海马神经元中Caspase-3的表达与模型组相比有所减少，被染为黄色，呈阳性。黄精高剂量组大鼠海马神经元中Caspase-3蛋白表达极少，染色很浅，仅见个别为弱阳性。提示黄精对AD大鼠海马组织Caspase-3蛋白表达有抑制作用，Caspase-3蛋白的表达随黄精剂量的增大而减少。见图1。

表1 黄精对AD大鼠水迷宫实验的影响(±s)

表1 黄精对AD大鼠水迷宫实验的影响(±s)

与模型组比较:1)P＜0.01

组别 n EL(s) 所占距离的百分比(%) 探索次数(次/s)对照组 8 25.689 6±3.385 71) 34.865 0±6.624 51) 8.500 0±1.772 81)模型组 9 50.711 5±7.047 9 19.973 3±5.111 4 5.000 0±1.500 0黄精低剂量组 8 46.197 2±9.462 2 22.853 8±3.043 3 5.375 0±2.199 8黄精高剂量组 8 29.448 7±5.142 51) 34.208 8±4.671 31) 7.250 0±1.982 11)

图1 各组大鼠海马区Caspase-3表达(DAB，×400)

3 讨论

研究表明，引起细胞凋亡的各种因素均应先激活半胱氨酰天门冬酸特异性蛋白酶(Caspase)才能诱发细胞凋亡，说明Caspase家族在执行和控制细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用〔3〕，Caspase-3作为该级联反应中共同的下游凋亡执行因子，执行死亡程序，因此 Caspase-3被称为死亡蛋白酶〔4〕。Caspase-3可通过两条途径激活，一条是线粒体通道，生理或病理性刺激，使线粒体膜的通透性增高，释放细胞色素 C，Caspase-9激活并切割Caspase-3，使之转化为具有酶催化作用的活性形式;另一条为死亡受体通道，通过细胞表面的死亡受体(TNFaR1、FAS)，激活 Caspase-8，进而激活 Caspase-3〔5〕。近年来大量的研究表明，脑神经元对凋亡损伤极其敏感，这为AD进行早期干预、最大限度保护脑功能，从而减少海马神经元凋亡和丢失，以预防AD的发生提供了可靠的理论依据。本研究结果表明Caspase-3与衰老大鼠海马组织神经元的凋亡密切相关。黄精进行干预后大鼠海马神经元Caspase-3蛋白的表达较模型组有所减少，且随剂量的增加，Caspase-3蛋白的表达呈递减趋势。黄精治疗AD的机制可能是通过某种途径抑制Caspase-3的表达，减少海马神经元的凋亡。黄精作为一种对AD的治疗手段，为AD防治开辟了新的途径，将会在临床治疗AD预防AD方面发挥重要作用。

1 李 铣，郭月英，孙隆儒，等.黄精改善小鼠学习记忆障碍等作用的研究〔J〕.沈阳药科大学学报，2001;18(4):286-9.

2 石 林，蒙义文，李 伟.黄精及黄精多糖的药理研究〔J〕.天然产物研究与开发，1999;11(3):67-71.

3 Saikumay P，Dong Z，Mikhailov V，et al.Apoptosis:definition，mechanisms，and relevance to disease〔J〕.Am JMed，1999;107(5):489-506.

4 李小明，宋天保.“杀手”蛋白酶Caspase〔J〕.细胞生物学杂志，2000;22(2):58-63.

5 Budihardjo Ⅰ，Oliver H，Lutter M，et al.Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis〔J〕.Annu Rev Cell Dev Biol，1999;15:269-90.