猪细小病毒疫苗研究进展

孙海燕，葛 铭

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

猪细小病毒（PPV）能够引起母猪繁殖障碍疾病，导致母猪产死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母猪不育等。德国学者Mayr在用猪肾原代细胞进行猪瘟病毒组织培养时首次发现了PPV，我国学者潘雪珠等于1983年分离到该病毒，目前该病已呈世界性分布，给养猪业造成了严重的经济损失[1-4]。

PPV的感染尚无有效的治疗方法，疫苗免疫预防仍是控制该病的主要手段。目前PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因工程活病毒载体疫苗等，其中灭活疫苗具有安全性好、产生抗体时间长、不需要低温保存的优点；弱毒疫苗免疫效力较强、产生抗体快、用量少、成本低，但安全性较差；基因工程亚单位疫苗免疫源性较好，但成本和技术要求都比较高；基因工程活病毒载体疫苗可以同时预防两种病或多种病的、能够诱导较强的免疫反应，但生产技术复杂、成本较高；基因疫苗生产工艺简单、免疫剂量小、成本低廉、可构建多基因或多价疫苗，但其安全性受到广泛关注[5-7]。

1 弱毒疫苗

弱毒疫苗又称活疫苗，经人工致弱而失去对原宿主的致病力，但仍保持良好的免疫原性的病原体，或用自然弱毒病原体制成的疫苗。弱毒疫苗免疫力较强，产生抗体快，用量少，成本低，但存在毒力返强及散毒的可能，并需要低温贮运。目前的弱毒疫苗主要有NADL-2、HT株、HT-SK-C株和N株，这些弱毒疫苗主要在国外应用。最早应用于临床的是NADL-2弱毒株，该毒株是猪细小病毒强毒株在细胞上连续传50代以上致弱的。该毒株的VP2基因比强毒株NADL-8少300 bp。日本学者Fujisakl等将猪细小病毒野毒株在猪肾细胞上低温30℃连续传54代，产生了HT变异株，该毒株接种猪后能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力，并且不产生病毒血症，但能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力[8]。杜坚等对分离到的一株猪细小病毒自然弱毒株进行免疫接种试验证实，该弱毒株具有良好的免疫原性和保护力，并且不产生病毒血症[9]。尽管已有多株弱毒疫苗在临床上应用，但是由于PPV强毒株的大量存在，人们对病毒重组及弱毒返强的担心一直使弱毒疫苗的应用受到一定限制。

2 灭活疫苗

我国均普遍使用猪细小病毒灭活疫苗，使用的主要灭活剂有福尔马林、β-丙内酯（β-PL）、N-乙酰乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEI）等。有试验表明，猪细小病毒用福尔马林灭活后制成疫苗的保护效果不如用N-乙酰乙烯亚胺灭活后制成疫苗的保护效果好；用β-丙内酯灭活疫苗的保护力较好。免疫佐剂也是影响猪细小病毒灭活疫苗免疫效果的重要因素，但几种佐剂的混合物，如油佐剂、SDS、L-121、氢氧化铝和油乳剂的混合物以及SDS、氢氧化铝的混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前经常采用的佐剂是蜂胶、氢氧化铝和油水乳剂[10]。猪细小病毒灭活多联疫苗的使用较为广泛，主要有猪细小病毒-猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒-乙脑病毒等二联苗，因为除了猪细小病毒外，猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征障碍病毒（PRRSV）、乙脑病毒（JEV）等均能引起母猪的繁殖障碍，而且多联苗的使用可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪。

3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是将编码病毒的某种特定蛋白质的基因与适当质粒或病毒载体重组后导入受体（细菌、酵母或动物细胞），使其在受体中高效表达，提取所表达的特定多肽，加入佐剂制成的一种新型疫苗。其免疫原性较好，但技术要求高，成本昂贵，难以在临床上推广应用。尽管猪细小病毒的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒的防治中发挥了十分重要的作用，但是其均存在不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗存在重组和毒力返强的潜在威胁，而灭活苗的免疫效果不稳定。因此，研制更为安全有效的疫苗成为猪细小病毒免疫防制的主题。

4 基因工程亚单位疫苗

基因工程活病毒载体疫苗是利用基因操作技术，将异原性病毒的保护性抗原基因及启动子序列插入到作为载体的另一种病毒（如弱毒疫苗株）的基因组非必需区中，由于异原病毒基因已成为载体病毒基因组的一部分，可随载体病毒的繁殖而不停的表达，因而这种疫苗在机体可同时诱导产生针对载体病毒及异原性病毒的特异性免疫反应[11]。活病毒载体疫苗与弱毒疫苗相似，能诱导强而持久的免疫反应，而且作为载体的活病毒经过改造其安全性较传统弱毒疫苗大为提高。但其生产技术复杂，成本较高，目前仍多处于实验室研究阶段。

吴丹将猪细小病毒VP2基因及猪γ-干扰素（IFN-γ）基因同时克隆到真核表达载体中，构建了共同表达VP2和IFN-γ的基因免疫质粒，用此表达质粒单独或加入脂质体肌注接种小鼠，结果表明，脂质体可以加强表达质粒接种小鼠的免疫应答水平，为研制猪细小病毒基因疫苗提供了依据[12]。吕建强等将猪细小病毒的VP2基因插入到猪伪狂犬病病毒载体中，有望研制出猪细小病毒-猪伪狂犬病病毒二联重组基因工程苗[13]。

5 核酸疫苗

核酸疫苗又称基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗两种，目前研究中以DNA疫苗为主。核酸疫苗是含有编码蛋白基因序列的质粒载体，将质粒经一定途径导入宿主体内，并在宿主细胞中表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生相应免疫应答，达到预防疾病的目的。DNA疫苗在预防和治疗感染性疾病、变态反应和癌症等方面有着广泛的应用前景[14]。

与传统疫苗相比较，核酸疫苗免疫效果更好，DNA疫苗接种机体后，蛋白抗原是在宿主细胞内表达，其加工递呈过程都与病毒自然感染十分相似，从而激发较强的免疫应答，DNA疫苗既可以诱导体液免疫又可诱导强烈的细胞免疫，导入宿主体内的DNA载体不会受到母源抗体的影响，在许多动物疾病早期预防中意义重大；产生的免疫应答持久，导入的外源基因可以在宿主体内存在较长的时间，不断地表达蛋白抗原，能够持续地给机体免疫系统提供刺激，因此能够使机体产生持久的免疫应答；DNA疫苗可以通过质粒携带两个或多个抗原基因，从而构建多价疫苗或多联疫苗，大大提高疫苗的效果或达到接种一种疫苗预防多种疾病的目的；DNA疫苗不会出现弱毒疫苗和活载体疫苗的毒力返祖的危险；生产简单、运输方便，DNA疫苗只需构建高效表达的质粒，在细菌中生产，可在短时间内大量扩增并纯化，省去了传统疫苗的蛋白表达提纯等繁琐工作，干燥DNA疫苗在室温稳定性高，不需要冷藏设备，大大降低了储存和运输的成本。赵俊龙等用猪细小病毒的VP1和VP2基因分别构建了猪细小病毒的核酸疫苗，结果表明，这两种疫苗均能诱导产生较高水平的体液免疫和细胞免疫[15]。

DNA疫苗构建过程中目的基因的选定是决定疫苗免疫效果的关键，应选择病原主要的保护性抗原基因或将同一病原的多种保护性抗原基因同时克隆入载体中，另外，选择安全高效的表达载体质粒。不同的免疫途径对DNA疫苗的免疫效果也有一定的影响，目前采用的主要免疫途径为肌肉注射。对接种的组织进行预处理可提高外源基因表达量，增强免疫效果。研究发现，许多细胞因子的基因插入到疫苗DNA质粒中作为遗传佐剂，可以提高机体的免疫应答水平（例如干扰素基因、转移因子基因、IL-2等）[16]。DNA疫苗的安全性是被广为关注的问题，人们担心外源基因会整合到宿主的染色体上而导致细胞癌变。但迄今为止，研究者们还没有发现这样的整合性。理论上应用病毒DNA疫苗的转化作用和转化机率不会高于病毒的自然感染。由于DNA疫苗在体内引起的免疫反应较慢，不适于作为某些病毒的紧急接种。如何提高DNA疫苗的导入效率，也需要进行深入的研究[17-18]。

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