Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

王 卓，卢玉婷，魏 雪，张海斌，柯玉花，苗丽娟

（吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101）

猪圆环病毒（PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，并多发于5～16周龄的猪。该病最早发现于加拿大，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率达10%～30%，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪攻毒障碍的重要传染病。

本试验利用制备好的原核表达的PCV2 Cap蛋白，免疫Balb/c鼠，制备Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白的多克隆抗体，根据其抗体产生情况分析其抗体产生规律，生产出的多抗可以作为标准阳性血清用于酶联免疫吸附试验等，且在制备多抗过程中检测出抗体产生的规律，为制备圆环病毒的单克隆免疫程序奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PCV2 Cap蛋白由吉林农业科技学院实验室保存。蒸馏水、弗氏佐剂、PBS为国产试剂。雌性Balb/c鼠购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 动物免疫试验

将雌性Balb/c鼠6只随机分为对照组和试验组，每组3只。第1次免疫将定量的纯化好的PCV2 Cap蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合并完全乳化后，小鼠腹腔注射0.5mL·只-1；间隔15 d进行第2次免疫，佐剂用弗氏不完全佐剂，免疫方法和剂量同上；再间隔15 d后进行第3次免疫，佐剂用弗氏不完全佐剂，免疫方法和剂量同上。每次免疫后第3、7、10天采血，第3次免后的第10天采取小鼠眼球采血。对照组采用PBS免疫，免疫方法和剂量同免疫组。

1.2.2 抗血清制备方法

采取小鼠尾部或眼球血液，37℃1 h，4℃过夜，1 500 rpm离心5min，吸取上层血清，-80℃分装保存。

1.2.3 间接ELISA方法测定抗体效价

采用间接ELISA方法检测抗体效价，以纯化出的Cap蛋白为抗原，检测制备出的多克隆抗体效价，纯化后的融合蛋白按200 ng·孔-1包被酶标板，以对照组血清为阴性对照，将免疫血清和阴性血清同时作1∶100稀释后，用间接ELISA检测抗体OD值，具体步骤如下。将最后一次眼球采血中的待检血清按照1∶100、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800及1∶25 600稀释后，用间接ELISA检测抗体效价。

每孔加入100μL以碳酸盐缓冲液稀释的Cap蛋白抗原（终浓度为2μg·mL-1）包被96孔酶标板，4℃过夜，PBST洗3次后进行封闭；每孔加封闭液100μL（5%脱脂乳），37℃放置1 h后，PBST洗3次；每孔加100μL以PBST梯度稀释的被检血清，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体（1∶5 000稀释）100μL，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入新配制的OPD显色溶液100μL，置暗盒中10～20min后，每孔加入50 μL终止液（2mol·L-1H2SO4）终止反应。

1.2.4 结果判定

将96孔酶标板置于酶标仪492 nm处，测定每孔的OD值，结果以P/N≥2.1判定为阳性。

1.2.5 多克隆抗体的鉴定

将纯化的PCV2 Cap蛋白经SDS-PAGE电泳后，经BG-trans BLOT迷你转移芯湿转2 h，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳4℃封闭过夜。PBST洗5次，用添加0.1%～0.2%的Tween-20封闭液1:100稀释制备的鼠血清和阴性血清，37℃2 h。PBST洗5次，浸入含0.1%～0.2%的Tween-20封闭液1∶5 000稀释的红外染料标记羊抗鼠荧光二抗（避光），37℃放置1 h，PBST洗涤 5次（避光），用PBS再洗涤2次去膜上残留的Tween-20（避光），用Odyssey红外成像系统进行扫描。

2 试验结果

2.1 抗体检测结果

抗体检测结果见表1。

表1 抗体检测结果

由表1可知，第1次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗体阳性与阴性比值（P/N）是分别为1.5、1.8、2.1，1.9、1.6、2.1，1.6、1.7、2.1；第2次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗体P/N是 2.3、2.9、3.7，2.3、2.7、3.6，2.3、2.8、3.6；第3次免疫后第3、7、10天采血3只老鼠的抗体P/N 为 3.9、 4.6、 4.6， 3.4、 4.7、 4.9， 3.6、 4.6、4.7。结果表明，在第1次免疫后第10天的抗体P/N≥2.1，说明第1次免疫后第10天的血清可以作为阳性血清。

2.2 多克隆抗体效价的测定

多克隆抗体效价的测定结果见表2。

表2 不同血清稀释倍数的多克隆抗体效价

由表2可知，小鼠最后采血测定其血清效价，结果表明，其抗体效价为1∶12 800（P/N＞2.1）。

2.3 抗体产生规律

小鼠第1次免疫后10 d开始产生抗体P/N＞2.1，第2次免疫后抗体水平明显升高，第3次免疫第7～10天后抗体水平基本不变。

2.4 Western blot检测结果

Western blot检测结果见附图。

附图 应用纯化的蛋白对多抗进行鉴定的结果

由附图可知，在26kDa附近出现单一的条带，说明制备的鼠多抗是目的蛋白诱导产生的特异性抗体。

3 讨论

抗原和抗体是免疫学检验的两大重要因素，也是整个免疫反应的基本条件。抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白。特异性抗体是免疫应答中的重要产物，也是免疫学实验中常用的试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学诊断中应用极为广泛。

目前人工制备的特异性抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。单克隆抗体用杂交瘤技术制备，近年来又出现了基因工程抗体（单链抗体），多克隆抗体存在于免疫动物抗血清中[1]。前者生产成本高、周期长，实验技术要求高，故本研究选择制备多克隆抗体，更主要是为单克隆抗体制备的免疫程序奠定试验基础。

制备高效价、高特异性的免疫血清必须有理想的免疫原、挑选适合的动物。蛋白质是良好的抗原，本实验制备的PCV2 Cap融合蛋白已经亲和层析法纯化，达到7.29mg·mL-1可作为免疫原免疫小鼠，制备抗血清[2-3]。

4 小 结

本试验制备的Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白多克隆抗体效价达到1∶12 800，制备的抗体产生规律是第1次免疫小鼠后第10天开始产生阳性抗体，第2次免疫后抗体水平明显升高，第3次免疫后第7～10天抗体水平基本保持不变。

[1]苗丽娟.猪圆环病毒检测方法的研究进展[J].饲料博览,2011（2）:49-51.

[2]苗丽娟,符芳,王小武,等.猪圆环病毒2型去核定位信号ORF2基因的原核表达与初步应用[J].中国预防兽医学报,2008（5）:26-29.

[3]应用RNAi技术抑制猪圆环病毒2型的复制和表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的杆状病毒的免疫保护作用[D].扬州:扬州大学,2008.