点击化学反应原位制备海藻酸钠水凝胶

张 桥, 鄢国平，程巳雪

(1．武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉 430074；2．武汉大学化学与分子科学学院生物医用高分子材料教育部重点实验室，湖北 武汉 430072)

0 引 言

海藻酸钠(alginate)是一种天然多糖，具有很好的生物相容性，被广泛用于食品和医用领域.海藻酸是由古洛糖醛酸(G单元)和甘露糖醛酸(M单元)两种结构单元组成的线性嵌段共聚物，其中G单元可以与钙、铜、锌等二价离子螯合，在温和的条件下迅速形成水凝胶.由于形成的水凝胶无毒无害，被广泛应用于药物载体、组织工程支架、细胞微胶囊化等领域[1-2].但是离子交联的海藻酸钠水凝胶放置一段时间后机械强度会逐渐下降，这可能是因为交联的离子会扩散到周围的溶液中，从而使水凝胶的交联密度下降.用双功能团的交联剂共价交联海藻酸钠可以得到更为稳定海藻酸钠水凝胶[3].例如先用高碘酸钠氧化海藻酸钠，然后用己二酸二酰肼交联，可得到机械强度较高的水凝胶[4].但是用普通化学交联需要在较苛刻的条件下反应，并可能引入有害的催化剂，降低海藻酸钠水凝胶的生物相容性.

点击化学是一类选择性高、反应速率快、产率高的化学反应.由于它反应条件温和，基本没有副产物，已经广泛用于药物开发和生物医用高分子材料的制备[5-7].用点击化学制备的高分子材料具有较好的强度和生物相容性.有研究报道，细胞可以在用“点击”化学制备的透明质酸水凝胶内生长[8].本研究合成了叠氮化和炔基化的海藻酸钠，再利用叠氮基和炔基之间的环加成点击化学反应制备海藻酸钠水凝胶，该水凝胶具有较大的孔径和pH敏感性.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

海藻酸钠(Mw=2.85×105)购自国药集团，丙炔胺购自Sigma，乙醇胺使用前减压蒸馏.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自国药集团, 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)购自上海宝曼生物试剂有限公司, 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲盐购自Amresco, 其它试剂均为国产分析纯试剂.

1.2 海藻酸钠水凝胶的制备

1.2.1 叠氮基和炔基海藻酸钠的合成 在10 ℃ 将30.5 g 40% 溴化氢缓慢滴加到6.1 g乙醇胺中，滴加完成后10 ℃ 反应1 h,继续滴加30.5 g 40% 溴化氢之后,加入35 mL二甲苯，升温回流，同时用分水器分水，减压蒸馏二甲苯，冷却，再用丙酮洗涤二次，得产物2-溴代乙胺溴酸盐17.28 g，收率 84.3%.

将3.9 g叠氮化钠溶于20 mL蒸馏水中，再加入4.1 g 2-溴代乙胺溴酸盐，在 75 ℃反应21 h后，冷却到0 ℃，加入20 mL乙醚和4 g氢氧化钾，分离有机相，水相用100 mL乙醚萃取3次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥过夜后，过滤，旋蒸去除乙醚得产物2-叠氮乙胺0.838 3 g,收率48.7%.

将0.515 g海藻酸钠溶于25 mL MES缓冲液中(50 mM, pH=4). 加入0.288 g，EDC·HCl和0.173 g NHS,活化海藻酸钠上羧基，再加入346 μL 2-叠氮乙胺或166 μL丙炔胺室温反应24 h后，用透析袋(截留分子量8 000～12 000)透析5 d，最后将溶液冻干得到叠氮基海藻酸钠(Alg-N)和炔基海藻酸钠(Alg-C).

1.2.2 海藻酸钠水凝胶的制备 称取60 mg Alg-N和60 mg Alg-C溶于2.4 mL蒸馏水，再加入1 mL 1%(w/v)的氯化亚铜溶液，剧烈搅拌，几分钟后即可到稳定的海藻酸钠水凝胶Alg-Gel.水凝胶用10 mM的EDTA溶液透析12 h, 再用蒸馏水透析24 h.

1.3 海藻酸钠水凝胶的表征

将干燥的海藻酸钠、叠氮基海藻酸钠、炔基海藻酸钠和海藻酸钠水凝胶磨碎后，用KBr压片，由Perkins Elmer-2红外分光光度计测定其红外光谱图.

在水凝胶达到吸水平衡后冻干，冻干后的截面形貌由SEM(Hitachi X650，Japan)观测.

1.4 水凝胶溶胀比的测定

精确称取一定量的干凝胶(W0)放入小烧杯中，浸入不同的pH缓冲溶液中，达到溶胀平衡后取出，用滤纸拭去表面吸附的水后，准确称取湿凝胶的质量(W1)，按下式计算水凝胶的溶胀比(S).

S=(W1-W0)/W0×100%

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的制备与表征

本研究利用乙醇胺通过溴化反应、叠氮化反应合成了2-叠氮乙胺，再利用EDC·HCl和NHS将2-叠氮乙胺和丙炔胺分别与海藻酸钠缩合，得到叠氮基海藻酸钠和炔基海藻酸钠，最后用一价铜催化的叠氮基和炔基的环加成反应制备海藻酸钠水凝胶.在叠氮化海藻酸钠和炔基化海藻酸钠的混合水溶液中加入氯化亚铜水溶液，激烈搅拌静置几分钟后可得到稳定的水凝胶，得到的水凝胶需要用EDTA和纯水透析，去除亚铜离子.与其它通过化学交联制备海藻酸钠水凝胶的方法相比，本方法反应条件温和、简单方便.

由于炔基和叠氮基都是特殊功能基团，利用红外图谱可以表征叠氮化海藻酸钠和炔基化海藻酸钠的结构[9].如图2所示，Alg-C的红外光谱图含有2 095 cm-1炔基特征峰，Alg-N的红外光谱图含有2 109 cm-1叠氮基特征峰，说明通过氨基和羧基的缩合反应可以分别将炔基和叠氮基引入海藻酸钠中.Alg-Gel红外图谱中2 095 cm-1处炔基特征峰消失，2 109 cm-1叠氮基特征峰显著减小，说明炔基化海藻酸钠和叠氮化海藻酸钠之间发生了点击化学反应,生成了化学交联的海藻酸钠凝胶.

图3是水凝胶达到吸水平衡后经冷冻干燥后的截面电镜图，用点击化学制备的海藻酸钠水凝胶具有与普通水凝胶相同的多孔网状结构，但孔径较大，平均孔径大约为60 μm. 通常在制备大孔径的水凝胶时，需要加入致孔剂，例如PEG[10]. 致孔剂通过空间位阻效应产生较大孔径.本研究获得的大孔径水凝胶可能是含炔基和叠氮基的侧链提供了相类似的空间位阻.另外，水凝胶较大的孔径也可能是凝胶交联密度较低所致.

图1 点击化学制备海藻酸钠凝胶的路线

图2 海藻酸钠、海藻酸衍生物和海藻酸凝胶的红外光谱图

图3 点击化学制备的海藻酸钠水凝胶的SEM图

2.2 水凝胶溶胀行为分析

图4 pH值对海藻酸钠水凝胶溶胀率的影响

通常如果水凝胶含有弱酸性或弱碱性基团都会有一定的pH敏感性.用“点击”化学合成的海藻酸钠水凝胶含有羧酸根.其在一定pH范围内可以转化为羧基，从而影响水凝胶的溶胀率.由图3显示出本方法合成的海藻酸钠水凝胶具有pH敏感性.在溶胀过程中pH值较高时，水凝胶中网链上的羧酸根带负电，由于静电的相互排斥作用，使得水凝胶网络扩张，从而溶胀率较高.而随着pH 值的降低，水凝胶中的羧酸根转化为羧酸，凝胶网络中的静电作用消失，所以溶胀率较低.

3 结 语

本研究合成了炔基和叠氮基海藻酸钠，并首次用炔基和叠氮基之间的点击化学反应制备了海藻酸钠水凝胶.由于在水凝胶的制备过程中炔基和叠氮基侧链的空间位阻效应使得制备的水凝胶具有较大的孔径.此外，水凝胶具有pH敏感性.本方法较其它化学交联海藻酸钠制备水凝胶的方法快速方便，反应条件温和.有望成为药物控制释放的载体材料.

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